细胞生物学/显微技术

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细胞生物学研究方法 - 显微技术 - 细胞的分离和培养 - 细胞组分的分离和纯化技术 - 细胞化学和细胞内分子示踪技术 - 细胞功能基因组学研究技术
人眼的生理结构限定了其分辨能力约为lOOµm。典型的动物细胞直径为10~20µm, 而核糖体、抗休、ATP等细胞内众多重要的复合体或分子的直径都在1~100nm的纳米尺度范围内。因此,观察细胞的生命活动必须借助显微镜。显微镜技术经历了光学显微镜技术、电子显微镜技术和纳米显微镜技术的发展阶段。降低最小分辨间隔、呈现细胞内的精细结构,甚至实时呈现活细胞内分子间的作用过程是显微镜技术发展的直接成果。对细胞生命活动进行探索的需求推动了显微镜技术的进步,而显微镜技术的进步也极大地推动了整个生命科学研究的发展。

光学显微镜技术[编辑]

尽管A.Van Leeuwenhoek在17世纪70年代用他自制的显微镜看到了细菌和动物的精子细胞,但直到19世纪初制造出具有更高分辨能力的光学显微镜时,才确认所有的动物和植物都是由细胞构成的,即细胞学说(cell doctrine)。可以说光学显微镜与细胞生物学同步而生,不断发展,是细胞生物学必不可少的研究工具。近年来,由于各种新型示踪分子、光学原理以及计绊机数据处理等技术的应用使得光学显微技术的作用日益重要。

普通光学显微镜的分辨率[编辑]

光学显微镜(light microscope)主要由聚光镜、物镜和目镜三部分组成。衡量显微镜成像能力的主要指标是显微镜的分辨率(resolution, R)。分辨率是指能够区分相近两点的最小距离。能够区分的两点的距离越小,则显微镜的分辨率越高。普通光学显微镜的横向分辨率(Rx,y)和纵向分辨率(Rz)可按以下公式计算:
Rx,y=0.61λ/n·sinθ, Rz=2λ/(n·sinθ)2
n·sinθ为镜口率,亦称数值孔径(numerical aperture, NA); n为聚光镜和物镜之间介质的折射率(空气约为1,油浸镜的镜油为1.3~1.5);θ为标本对物镜镜口张角的半角(sinθ的最大值为1); λ为照明光源的波长(人眼敏感的波长为555nm,白光一般采用527nm)。
综合各种影响因素,普通光学显微镜理论上的横向分辨率为250nm,纵向分辨率为550nm。由于生物样品性质和显微镜制作工艺的限制,光学显微镜实际应用中的横向分辨率约为0.5µm, 而纵向分辨率约为lµm。线粒体大小约为0.5µm, 是普通光学显微镜通常能观察到的细胞内最小结构。一般将光镜下所见物体结构称为显微结构(microscopic structure)。
普通光学显微镜的放大系统般由物镜和目镜组成。物镜靠近被检物体,进行第一次放大,目镜靠近眼睛,将物镜放大后的图像再放大。物体经过两次放大后,总放大倍数为两次放大倍数的乘积。放大倍数越大并不意味着越能够看清楚更小的物体,光学显微镜放大倍率的最高极限为1600倍。
多数细胞总重量的70%是无色透明的水,只有很少的内含物不透光。因此,未经处理的细胞在普通光镜下几乎是看不见的。使细胞成为可见的常用方法就是用染料对细胞的不同组分进行染色(staining)。一些纺织用染料被发现可用于生物组织的着色,并对细胞的特殊部位具有选择性,如苏木精(hematoxylin)对负电荷分子有亲和性,能显示出细胞内核酸的分布;酸性染料如伊红(eosin)可使细胞质染色;苏丹染料(sudan dye)在脂肪中的溶解度比在乙醇中大,所以苏丹染料的乙醇饱和溶液能使脂肪着色。尽管已发现了许多特异性染料,但其大部分的作用机制尚不清楚。
生物组织在染色前必须固定(fixation), 固定使得大分子交联而保持在原有的位置上,不至于在以后的染色等处理过程中移位或丢失而产生人工假象。常用的固定方法是将组织放在固定液中,如甲醛或戊二醛溶液,这两种分子都能够与蛋白质的游离氨基酸形成共价键,从而将邻近的蛋白质分子牢固地交联在一起。
大部分的组织太厚而不能在显微镜下直接观察,固定后还需制成薄切片(section), 然后将切片黏附在载玻片表面进行染色。但由于固定后组织仍很柔软,在切片前需用支持剂——蜡或树脂进行包埋(embed)。适用于光镜观察的切片厚度为l~lOµm。

相差显微镜通常用于观察活细胞[编辑]

在观察样品的制作过程中,细胞成分的丢失或失真通常是难以避免的。若想避开这个问题,只有不加固定、染色等程序,直接观察活细胞,这需要特殊的光学系统。
光的波长决定可见光的各种色彩,振幅决定光的亮度。波长和振幅的改变能够被入眼所辨识。光在通过活细胞时,波长和振幅几乎没有改变,但由于细胞各结构的密度不同,通过致密部分(如细胞核)的光线,速度变慢,与通过邻近部位(如细胞质)的光线之间产生相位偏差或光程差,这种差异人眼不能分辨。相差显微镜(phase contrast microscope)利用光的衍射和干涉效应把透过标本不同区域的光波的光程差变成振幅差,使活细胞内各种结构之间呈现清晰可见的明暗对比。
观察培养细胞的结构常用倒置相差显微镜,它的特点是光源和聚光镜装在载物台的上方,相差物镜在载物台的下方,可以清楚地观察到培养瓶内的贴壁或悬浮细胞。
相差显微镜的最大优点是能够观察活细胞的活动,但由于许多细胞运动缓慢,难以在短时间内完成观察,因此需要用显微电影摄影术(microcinematography)或电视录像(video recording)以一定时间间隔拍摄记录。当影片或电视录像带以正常速度放映时,所拍摄的情节就被大大地加快了,用这种方法可以准确地记录细胞或细胞器的运动过程和速度。

暗视野显微镜通过散射光成像[编辑]

暗视野显微镜(dark-field microscope)是将光源以一定的角度倾斜照射到样品上,照射光无法进入物镜,只有从被照样品发出的散射光能进入物镜被放大,在黑暗的背景下呈现明亮的像。暗视野显微镜主要是观察物体的轮廓,分辨不清内部的微细构造,适合于观察活细胞内的细胞核和线粒体、液体介质中的细菌和真菌等。暗视野显微镜也可用于观察细胞的运动。

荧光显微镜可以呈现强反差的彩色图像[编辑]

荧光分子可以在吸收特定波长的光后,发射出更长波长的可见光,前者称为激发光(excitation light), 后者称为发射光(emission light)。由于荧光分子可以使被检样品呈现不同的染色,因此也称荧光染料。细胞内某些天然物质如叶绿素就是荧光分子;一些细胞成分虽然不是荧光分子,但可以用荧光分子对其进行染色或标记,这在实际当中有着广泛的应用。比如,吖啶橙能对细胞DNA与RNA同时染色,显示不同颜色的荧光。DNA呈绿色,RNA呈红色。与抗体共价结合的荧光分子,可以用来特异性地检测细胞表面或固定后的细胞内特定的抗原。
与普通光学显微镜相比,荧光显微镜(fluorescence microscope)在结构上的突出特点是具有两组滤光片。第一组滤光片在光源与标本之间,仅能通过荧光染料的激发光;第二组滤光片在标本与物镜之间,仅能通过激发出的荧光。荧光显微镜观察到的像是以暗背景为映衬的,因此具有成像反差强,检测灵敏度高的特点。此外,使用荧光显微镜观察细胞内标记了不同荧光染料的分子可以呈现彩色图像。多种对细胞内特定离子有特异亲和性或依赖于细胞内酶的催化作用才能发出荧光的活体荧光染料,使人们可以对活细胞内分子的动态变化进行实时观察。基于以上特点,荧光显微技术被广泛应用于细胞生物学研究。

共聚焦激光扫描显微镜可以提供高清晰的彩色三维图像[编辑]

用普通光学显微镜观察标本的菏切片,无法得到三维结构的信息,且光学显微镜是全视野照明,来自焦平面前后的漫射光线参与最后成像,降低了图像的反差和分辨率。共聚焦是指物镜和聚光镜互相共焦点,亦即两者同时聚焦到一个点,保证了只有从标本焦面发出的光线聚焦成像,焦面以外的漫射光不参加成像,因此能有效抑制背景噪声,提高信噪比,使图像更加清晰。此外,由共聚焦产生的纵向分辨率的增强,使对细胞内部结构进行“光学切片”成为可能。这是共聚焦显微镜与普通光学显微镜相比的突出优势。共聚焦激光扫描显微镜(confocal laser scanning microscope, CLSM)以单色激光作为光源,对样品焦平面进行扫描,产生二维图像,改变焦平面即可得到一系列二维图像。图像信息经计算机重建,就可得到完整的三维图像,并可从空间的任意角度观察标本的整体结构。
CLSM多用于检测发射荧光或用荧光标记的物质,其横向和纵向分辨率一般为200nm和500nm, 基本达到了光学显微镜分辨率的理论值。由于其操作简便,可观察活细胞,在细胞生物学的研究中被广泛应用。CLSM可以辨别细胞内许多复杂物质的三维结构,包括构成细胞骨架系统的纤维、染色体及基因的排列等。

超分辨光学显微镜的分辨率达到纳米尺度[编辑]

光的衍射效应,即穿过小孔径后的光会发生扩散,使光不能用来观察比其本身波长短得多的细节。这是光学显微镜存在分辨率极限的主要原因。1873年德国人Ernst Abbe首先阐明了衍射效应对光学显微镜分辨率影响,确定了物镜镜口率、照明光线波长与显微镜分辨率的关系。因此,通常将由于光的衍射效应导致的光学显微镜分辨率极限称为Abbe限度(Abbe limit)。近几年来,在应用新的光学原理(如非线性光学原理)、发光/示踪分子和信号分析技术的基础上,已经建立起了实用的能够突破Abbe限度的超分辨显微技术(super-resolution microsopy), 使光学显微镜的分辨率达到了30~50nm的纳米尺度。
超分辨显微技术主要是根据荧光分子的发光特性和物理机制,使距离衍射限度内的两个邻近荧光分子差异激发,以呈现分辨率超越Abbe限度的图像。也就是说,超分辨显微技术利用荧光基团的物理或化学特性,使相邻的衍射限度内的分子处于不同的的状态,以使彼此区分开来。一般可将超分辨率显微技术可以分为两类:一类是集成成像技术,利用结构化光照明在空间上调制位于衍射限度内分子的荧光行为,使全部荧光分子不同时发射,以此来获得分辨率小于衍射限度的图像,如受激发射损耗(stimulated emission depletion, STED)技术、相关的可逆饱和线性荧光跃迁(reversible saturable optical linear fluorescence trans山ons, RESOLIT)技术,以及饱和结构光照明显微技术(saturated structured illumination microscopy, SSIM); 另一类是单分子成像技术,利用光开关(photo switching)或其他机制在不同的时点随机激活位于衍射限度内的单个分子,然后测量每一个单独荧光基团的位置,并进行三维重建,以此获得衍射限度内的图像,如随机光学重建显微技术(stochastic optical reconstruction microscopy, STORM)、光激活定位显微技术(photoactivated localization microscopy, PALM)和荧光光激活定位显微技术(fluorescence photoactivation localization microscopy, FPALM)。
超分辨显微技术利用可见光(380~740nm), 具有非接触、无损伤、可观测内部结构的特点。这些特点使其可以观测活的组织或细胞,并可进行内部深层三维结构成像。同本节后面介绍的能够达到纳米尺度的显微技术,即电子显微镜技术、扫描隧道电子显微镜技术和原子力显微镜技术相比,超分辨显微技术在细胞生物学研究中具有较明显的优势,随着其技术和设备的发展和完善,必将像普通光学显微镜一样,在生命科学研究中具有广泛应用。

电子显微技术[编辑]

光学显微镜的分辨率受照明光源波长的限制,无法分辨小于0.2µm的微细结构。电子的波长比光要短得多,电子显微镜(electron microscope, EM)用电子束做光源大大提高了显微镜的分辨率。电子运动越快,波长就越短,以10万伏特电压加速的电子,其波长约为0.004nm。 理论上,用这样短波电子照明,显微镜的分辨率可达到0.002nm, 但由于电磁透镜的相差比玻璃透镜的相差要大得多,电镜的实际分辨率不超过0.1nm。这样的分辨率用于检查金属材料时,可以清晰看到相邻的金原子间的距离(0.2nm)。生物样品由于标本的制备,反差及照射损伤等原因,电子显微镜的分辨率实际上仅约2nm, 尽管如此,它仍是光学显微镜分辨率的100倍,可以观察到细胞膜、细胞核、线粒体、高尔基复合体、核糖体、中心粒等细胞器的微细结构。这种在电子显微镜下观察到的细胞的结构称为亚显微结构(submicroscopic structure)或超微结构(ultrastructure)。

透射电子显微镜用于观察细胞的超微结构[编辑]

电子显微镜通常是指透射电子显微镜(transmission electron microscope, TEM), 它的总体设计与光学显微镜相似,但要大得多,且上下颠倒。照明光源是释放电子的钨丝,作为阴极位于约2m高的镜筒顶端。电子能与空气中的分子碰撞而发生散射,故需将镜筒中的空气抽出保持高度真空状态。由灯丝发射的电子受到其下方阳极吸引而加速,通过一个中央小孔而形成电子束,沿镜筒向下运动。沿镜筒设置的精密线圈产生轴对称磁场从而作为电磁透镜使电子聚焦,就如同光学显微镜中光线被玻璃透镜聚焦那样。标本通过一个气闸送入镜筒,置于电子束的通道上。电子束通过标本时,根据标本各部位密度的不同,部分电子发生散射,只有剩余的电子成像,经物镜和投影镜等放大后投射到照相底片上或荧光屏上。散射的电子不参加成像,故标本中密度大的部分成像后形成电子流蜇减少的暗区,相反,标本密度小的部位散射电子少而形成明区。
用于电镜观察的生物标本需特殊制备。电镜标本必须置于高真空中进行观察,所以含水的活组织细胞是无法观察的。为防止生物样品在死亡后和在脱水过程中产生结构改变,离体的生物标本要迅速加以固定。常用戊二醛和四氧化锇双重固定,戊二醛在蛋白质分子之间形成共价键将它们交联固定,四氧化俄除了与蛋白质共价结合之外,还对多种成分特别是对脂类有良好的固定效果。
电子的穿透力很弱,镜检前必须将固定后的组织制成50~100nm, 即约细胞的1/200厚度的超簿切片。为此,要将固定和脱水的标本放入液态的单体树脂中浸透,加温使之聚合成为固体的包埋块。在特定的超薄切片机上,用玻璃刀、钻石刀将包埋块切成超薄切片,最后将切片置于直径3mm的金属载网上进行观察。
电镜下所见到的标本的反差,取决于组成元素的原子序数,原子序数越高,散射的电子越多,反差越大。生物分子主要是由一些低原子序数的轻元素(氢、氧、碳、氮等)组成的,它们散射电子的能力非常弱,在电镜下难以见到明暗反差。为此,常常在切片前后用一些锇、铀、铅等重金属的盐类浸染标本进行电子染色,以增大反差。细胞的不同成分对这些盐类有不同的亲和力,造成染色程度的不同,显示不同的反差。例如,锇对脂质容易着色,用来观察细胞的各种膜性构造效果非常好。
高压透射电镜(high-voltage electron microscope, HVEM)的光源的加速电压一般在20万伏特以上。加速电压在50万伏特以上则称为超高压电子显微镜。目前世界上已有加速电压在300万伏特的超高压电镜。超高压电镜由于增加了加速电压,增强了电子的穿透能力,可以观察更厚的电镜切片。在10万伏特下,可见到3~7µm厚切片中的细胞超微结构,加速电压为300万伏特时,可以观察到10µm厚切片内的超微结构。而且加速电压越高,电子波长越短,电镜的分辨率也越高。
透射电子显微镜借助金属投影、冰冻断裂及冰冻蚀刻技术可获取三维图像。
金属投影法(metal shadowing)把带有干燥样品的载网放在真空罩中,高温蒸发铂或钯等重金属,使金属颗粒以一定的倾斜角度喷向样品。这样,随着样品表面的高低起伏,重金属形成不同厚度的薄膜,显示了投影(shadowing)效果,给出了一个样品表面结构的三维图像。如果喷镀的样品很小或喷镀后的金属膜薄得足以使电子束透过,则可以直接用透射电镜进行观察,比如一些蛋白、核酸类大分子,病毒颗粒及细胞壁这样的样品。对厚样品则需在喷镀后将样品部分溶去,仅剩薄薄的样品的金属复型(replica), 再用碳元素垂直喷镀形成一碳膜,加固复型,然后在透射电镜下观察复型。下述冰冻断裂与冰冻蚀刻两种技术是金属复型法的最好应用事例,为细胞生物学的研究作出了重大贡献。
冰冻断裂(freeze-fracture)多用于观察细胞膜性结构的内部构造。将样品用液态氮(-196℃)快速冷冻后,用刀切割冻结的样品组织块。切面常常从膜脂质双层的中央疏水部通过,暴露出膜的内部构造。将暴露出的切面用铂进行喷镀,制成复型后观察。用此技术对蛋白质在膜内的分布悄况进行观察,方便、直观,具有划时代意义。
冰冻蚀刻(freeze-etching)与冰冻割断法一样,低温(液态氦,-269℃)下切割后,徐徐升温,真空下使水分升华(冷冻干燥),在细胞周围的冰迅速减少下陷的同时,细胞内的游离水也减少下陷,膜和其他一些结构暴露出来,制作复型后有显著的断面浮雕效果,用于观察细胞的内部构造。

扫描电子显微镜用于观察生物样品表面的立体结构[编辑]

用透射电镜观察超薄切片仅能反映细胞的二维结构,虽然可以通过观察大量的连续切片重建立体图像,但费时费力,步骤繁琐。用扫描电子显微镜(scanning electron microscope, SEM)可以直接观察标本表面的三维形态。扫描电镜比透射电镜小,结构简单。透射电镜是电子透过标本后成像,扫描电镜是电子束照射在标本后产生二次电子成像。样品需经固定、干燥并用重金属膜覆盖。由光源发出的非常细的电子束(一次电子)在样品表面逐点逐线地扫描,产生的散射,即二次电子信号被收集、转换放大,在电视荧光屏上同步扫描成像。样品产生二次电子多的部位在荧光屏上相应的点就亮,反之则暗。由于二次电子产生的多少与电子束在标本表面的投射角有关,亦即与样品的表面起伏有关,在荧光屏上就会得到样品表面形貌的立体图像。
扫描电镜分辨率较低(3~10nm), 不及透射电镜,多用于细胞整体或组织的观察。

冷冻电镜用于解析生物大分子的结构[编辑]

在低温下使用透射电子显微镜观察样品的显微技术,被称为冷冻电子显微镜技术,简称冷冻电镜(cryo-electron microscopy, cryo-EM)。冷冻电镜是重要的结构生物学研究方法,它与另外两种技术:X射线晶体学(X-ray crystallography)和核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)一起构成了高分辨率结构生物学研究的基础,在获得生物大分子的结构并揭示其功能方面极为重要。经过三十多年的发展,冷冻电镜技术已经产生了多种解析生物分子或细胞结构的方法。2017年诺贝尔化学奖授予三位冷冻电镜领域的学者,表彰他们“在开发用于溶液中生物分子高分辨率结构测定的冷冻电子显微镜技术方面的贡献”。
目前备受瞩目的冷冻电镜结构解析则主要是指单颗粒三维重构技术。该方法通过对大量离散分布的单个分子的电子显微像进行统计分析来解析生物大分子的三维结构。
快速冷冻可以使蛋白质和所在的水溶液环境迅速从溶液态转变为玻璃态,玻璃态能使蛋白质结构保持其天然结构状态 如果以缓慢温和的方式冷冻,这个过程会形成晶体冰,生物分子的结构将被晶格力彻底损坏。低剂量冷冻成像能够保存样品的高分辨率结构信息,确保了从电镜图形中解析蛋白质结构的可能性。与此同时,在电镜图像处理算法方面奠定和发展了这项技术的理论基础。 冷冻电镜技术大致可以分为三个主要步骤:①样品冷冻(保持蛋白溶液态结构);②冷冻成像(获取二维投影图像);③三维重构(从二维图像通过计算得到三维密度图)。
冷冻电镜技术的特点是:不需要大量样品,不需要结晶,即可迅速解析大型蛋白复合体原子分辨率三维结构。

其他显微技术[编辑]

从1665年R.Hooke第一次使用显微镜观察细胞以来,显微镜的发展经历了光学显微镜时代和电子显微镜时代,目前扫描探针显微镜(scanning probe microscope, SPM)也得到了很好的开发和应用。扫描探针显微镜实现了人们直接观察单个原子的梦想,而且还能对原子进行操控、组合,形成具有新的物理、化学、生物学特性的颗粒。扫描隧道显微镜和原子力显微镜是扫描探针显微镜体系的主体,由于它们的分辨率和可操控的颗粒在纳米水平,因此也称作纳米显微技术。

扫描隧道显微镜可直接观察到大分子的三维结构[编辑]

扫描隧道显微镜(scanning tunneling microscope, STM)是利用量子力学的隧道贯穿理论设计制造的,它使用一个直径为原子尺度的精密的探针在观察标本的表面进行扫描,探针尖不接触所研究样品的表面,与样品之间保持大约1nm的微小的间隙,在针尖和样品间施加一定电压,就会产生所谓的隧道效应,即在两者之间出现以一个根据观测表面形貌变化的隧道电流。当探针在平行于样品表面的恒定高度移动并扫描时(恒高方式),同步记录隧道电流的变化,就可以获得所观察物体表面的原子水平的微观信息。也可以通过反馈系统的调节,使探针尖随样品表面的变化上下移动扫描并保持恒定的隧道电流,此时记录针尖和样品表面的距离变化就可以得到表面的形貌特征(恒流方式)。
扫描隧道电镜的主要优点是有非常高的分辨率(侧分辨率为0.1~0.2nm, 纵分辨率0.001nm), 而且可以在大气和液体等非真空状态下工作,避免了其他电镜采用的高能电子束对样品的辐射和热损伤作用,因此在细胞生物学、分子生物学和日益发展的纳米生物学的研究中得到非常广泛地应用。迄今已经直接用扫描隧道显微镜观察到自然状态下DNA分子双螺旋结构中的大沟和小沟以及大肠杆菌的环状DNA的结构。

原子力显微镜可对单个分子进行操控[编辑]

原子力显微镜(atomic force microscope, AFM)是在扫描隧道显微镜基础之上发展起来的新型扫描探针显微镜,与扫描隧道显微镜相比,原子力显微镜的一个突出的优点是不需要所检测的样品具有导电性,它通过分析探针尖与样品之间的原子间作用力来获取所观察表面的微观信息,这对研究通常不 导电的生物材料是一项非常有意义的革新。
原子力显微镜的探针被置于一个弹性系数很小的微悬臂的一端,微悬臂的另一端固定。探针尖和被检测的样品表面轻轻的接触,针尖的原子和样品表面的原子之间的微弱的排斥力使对力的变化非常敏感的微悬臂的游离端发生弯曲,经过光学透镜准直和聚焦后投射在微悬臂背面的一束激光及其监测器能将这种微弱的曲度的变化转换为电流的变化。通过移动样品平台使探针在被检测材料的表面逐点作快速扫描时,样品表面的微细结构特征的三维坐标数据就被转换为图像信息并准确地呈现在屏幕上。
原子力显微镜的工作范围与扫描隧道显微镜相似,可以在三态(固态、气态和液态)状况下工作,但其分辨率不及后者,目前主要用于活细胞表面及生物大分子空间伸展及其结晶体表面的观测,例如肌动蛋白聚合动力学中自组织纤维的多态性分析。原子力显微镜可以对单个分子进行操作,通过检测操作后引发的生物化学反应来研究生物大分子和大分子复合物的功能,即进行所谓的分子手术 (molecular surgery)。
以扫描隧道显微镜和原子力显微镜为代表的纳米显微技术实现了人们直接观察和操控原子的梦想,也使纳米技术进入到生命科学的研究中。纳米技术与生命科学相结合,产生了21世纪最典型的交叉学科——纳米生物学。纳米生物学的发展使人们对生物大分子复合物和细胞生理活动的认识进入到前所未有的领域。