细胞生物学/细胞功能基因组学研究技术

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细胞生物学研究方法 - 显微技术 - 细胞的分离和培养 - 细胞组分的分离和纯化技术 - 细胞化学和细胞内分子示踪技术 - 细胞功能基因组学研究技术
现代细胞生物学强调在基因与蛋白质等分子水平上理解细胞的功能。基因表达水平的变化与细胞行为的变化密切相关。提高或降低某一基因在细胞内的表达,观察与之相应的细胞行为的变化,是确定基因功能的主要方法。在人类基因组计划获得的理论和技术突破的推动下,细胞生物学研究已经能够在全基因组的水平考察细胞功能和特性的变化,进入了功能基因组学时代。

基因表达的定量分析[编辑]

基因功能性产物(包括蛋白、RNA分子)含量的变化是真核细胞尤其是哺乳动物细胞基因表达调控的主要方面。定量地确定基因表达水平的变化,是现代细胞分子生物学研究的基本要求。

印迹杂交技术是定量检测基因表达变化的基本方法[编辑]

20世纪80年代后相继建立了能够定量检测RNA和蛋白质分子的Northern、Western印迹分析技术(Blotting)。其基本过程都包括:电泳分离待检测分子,将待检测分子转移到可方便操作的硝酸纤维素膜或PVDF膜上,然后将带有报告基团的探针(或抗体)与膜杂交(或孵育),最后通过同位素或化学发光试剂显示目的分子的条带,通过条带的深浅可判断目的分子的含量和分子量大小。
Northern印迹分析是检测组织或细胞中特异性mRNA的方法。它以带有放射性或非放射性物质标记的单链cDNA、RNA片段或寡核苷酸为探针,检测RNA分子,不仅能够定量检测基因表达水平(mRNA)的变化,而且能够提供基因不同转录本的转录长度信息。对小的RNA分子,如长度约20nt的miRNA分子,Northern印迹分析也能有效地检测。在进行检测时,首先从组织或细胞中提取总RNA或mRNA, 在琼脂糖凝胶电泳之前需要对RNA样品进行变性处理,以破坏RNA分子中的局部双螺旋结构,使整个RNA分子呈单链(便于分子杂交)。常用变性剂为甲醛或戊二醛。
Western印迹分析检测的是蛋白质分子,它是在蛋白质水平定量检测基因表达改变的主要方法,首先将经细胞裂解而获得的蛋白质样品进行SDS-PAGE分离,然后依次经过印记、抗体孵育和显示蛋白质条带等步骤。Western印迹分析以抗体分子作为检测分子,不仅能够识别细胞中不同种类的蛋白分子,而且能够识别同一种蛋白分子的不同修饰方式,如磷酸化、甲基化、泛素化等,是考察蛋白质含量、大小和活性状态的重要方法。
印迹分析是低通量的检测技术,步骤较繁琐,花费时间长。但印迹分析检测不需昂贵设备,结果准确,少有假象,也常被用于验证生物芯片等高通量研究方法获得的结果。

原位杂交可提供基因表达的时空信息[编辑]

组织细胞中基因的表达不仅存在量的差异,而且还存在表达时间和空间的变化。核酸原位杂交技术(in situ hybridization, ISH)是在RNA水平检测这些变化的基本方法。原位杂交以短的单链cDNA、RNA片段或寡核苷酸为探针,将探针与经过固定并提高了通透性的细胞、组织切片或胚胎进行杂交,以荧光分子或显色酶为报告基团,显示特定RNA(mRNA)分子在组织或细胞内分布,通过荧光信号或显色的强弱可以判断含量的变化。原位杂交没有组织和细胞的裂解步骤,并通过固定的方法将RNA分子保持在组织和细胞内的原位,因此展示细胞和组织内特定基因表达的时间和空间变化。

荧光实时定量PCR技术是检测基因表达变化的常规方法[编辑]

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)能够在体外对特定DNA序列进行重复性复制(扩增)。其反应体系包括:模板DNA、耐热的DNA聚合酶、引物、4种脱氧核苷酸(dNTP)及适当的反应缓冲液。PCR反应一般分为变性、退火、延伸三步骤进行:首先在95℃进行DNA双链解离;然后在50~65℃之间进行引物与DNA链的互不结合,即退火;最后在72℃由耐热DNA聚合酶合成与模板互 补的新的DNA链。此三步骤重复20~30个循环即可完成扩增反应。
普通PCR反应可以对目的DNA片段进行高效地克隆,能够非常灵敏地检测目的DNA片段。但由于PCR高效的指数扩增过程,在扩增结束后不同含量的初始模板都具有几乎相同量的终产物,因此不能对初始模板进行定量。荧光实时定量PCR(fluorescence real-time quantitative PCR, qPCR)技术在PCR反应体系中加入与DNA双链结合后能够发出荧光的荧光染料,或能够与靶序列结合并带有荧 光报告基团的探针。在PCR反应过程中,每次反应循环后,都会检测反应管中的荧光强度。以反应管中荧光强度达到阔值时所需的PCR反应循环个数(Cp值),表示模板中目的片段的初始含量。由于是在PCR反应进行过程中的检测,而不是在PCR反应结束时的终点检测,因此荧光实时定量PCR技术能够进行目的DNA片段的定量分析。
在检测组织细胞中基因表达时,首先需要将分离提取的RNA (mRNA) 反转录(reverse transcription)为cDNA, 然后再行荧光实时定量PCR。因之,qPCR也常称为荧光实时定量RT-PCR,是检测基因表达改变的简便方法。

基因表达的上调和下调技术[编辑]

为确定基因的功能,常需要在细胞和个体中对基因进行方向相反的两个操作,即提高基因表达水平(上调)和降低基因表达水平(下调)。与个体水平的基因操作技术相比,在细胞水平很容易对目的基因的表达水平进行控制。
熟练掌握基因的克隆技术是进行基因表达上调和下调研究的前提。基因克隆,通常指cDNA克隆(cDNA cloning), 即将mRNA逆转录形成的cDNA或通过体外聚合酶链式反应得到的基因片段,插入到能进行自我复制的载体(通常是质粒,plasmid),实现在受体细菌内大量扩增的过程。克隆过程中用到的载体被称为克隆载体(cloning vector)。为开展基因表达的上调和下调研究,需要借助适当的 限制性核酸内切酶(restriction nuclease), 从含有目的基因片段的克隆载体中酶解出目的基因DNA, 转移到能够启动目的基因表达的表达载体(expression vector, 通常是质粒或病毒载体)中。

外源性基因在细胞中的过表达是上调基因表达的主要方式[编辑]

通过脂质体包裹的基因转染(transfection)或病毒介导的感染等技术,就可以将带有外源性基因的表达载体导入动物和人类细胞。在表达载体启动子的驱动下,外源基因将获得过表达(over-expression), 从而实现上调细胞中的目的基因表达。

RNA干扰技术是下调基因表达的常用方法[编辑]

近年建立的RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术可比较简便地在低等生物(如线虫)或哺乳动物细胞水平对特定基因进行降低或功能丧失的操作。
RNAi的基本原理:一定数量的外源性双链RNA(dsRNA)进入细胞后,被类似于核糖核酸酶Ⅲ的Dicer酶切割成短的21~23bp的双链小干扰RNA(small interferencing RNA, siRNA), siRNA与解旋酶和其他因子结合,形成RNA诱导沉默复合物(RNA-induced silencing complex, RISC)。激活RISC需要一个依赖ATP的将小分子RNA解双链的过程。激活的RISC通过碱基配对定位到同源mRNA转录本上,并在距离siRNA 3'端12个碱基的位置切割mRNA。尽管切割的确切机制尚不明了,但每个RISC都包含一个siRNA和一个不同于Dicer的RNA酶。因此,siRNA能够以序列同源互补的mRNA为靶点,通过促使特定基因的mRNA降解来高效、特异地阻断体内特定基因表达,诱发细胞呈现出特定基因表达降低(knock down)表型。
RNAi技术操作简便,主要步骤是:首先人工化学合成或酶促合成RNA双链,然后直接通过脂质体包裹、或克隆到特殊的表达载体等技术将其转染到体外培养的哺乳动物细胞,主要用于基因功能研究。
也可以根据靶基因设计短发卡RNA(short hairpin RNA, shRNA), 克隆到表达载体。转染后的表达载体可以表达由环袢连接的正反义互补的短干扰RNA序列,行使RN儿的作用。另外,利用慢病毒构建的shRNA载体,与化学合成的siRNA和基于瞬时表达载体构建的shRNA相比,一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用,另一方面,可用于感染依靠传统转染试剂难以转染的细胞系如原代细胞、悬 浮细胞和处于非分裂状态的细胞,并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组,进行长时间的稳定表达。

CRISPR/Cas9基因编辑技术[编辑]

CRISPR的全称为:成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats); Cas是CRISPR连接蛋白(CRISPR associated protein)。CRISPR序列构成了决定切割位点特异性的非编码RNA,Cas 基因编码的Cas 蛋白具有核酸酶活性。
CRISPR序列转录产生两个非编码RNA分子, 依靠重复序列互补形成异二聚体,再与Cas蛋白结合。Cas蛋白能够将异二聚体RNA剪切加工成为一端为有20个碱基向导序列的成熟RNA分子(gRNA)。这段向导序列能够特异识别基因组DNA分子的互补序列,而Cas蛋白再次利用核酸酶活性将DNA分子切断。
在向导序列的3'端, Cas识别的DNA位点还必须有一个PAM (protospacer adjacent motif)区域。在酿脓链球菌的CRISPR系统里,紧跟于靶序列后的PAM序列是5'-NGG 。而Cas识别位点的特异性就由20个碱基的向导序列和3个碱基的PAM序列共同决定。现在商家已经直接将异二聚体RNA构建成一个有向导序列和与Cas蛋白结合序列的融合RNA(single-guide RNA, sgRNA), 从而将CRSIPR/ Cas系统简化成Cas蛋白和sgRNA两个组分。切割后对DNA断点附近的序列进行编辑,同样是非同源末端连接修复机制和同源重组的方式进行。目前,已发现了三种类型的CRISPR/Cas系统,Ⅱ型CRISPR/Cas系统在发挥功能时仅需要一种蛋白,即Cas9核酸酶参与。因此,CRISPR/Cas9系统得到了广泛应用。
CRISPR/Cas9技术是近年来出现的一种革命性技术,被广泛用于基因的敲除、点突变和外源性基因的插入等。
此外, 在动物和人类细胞中过表达特定基因编码蛋白的部分功能域缺失或基因突变体,也是研究基因功能的常用方法。

蛋白质相互作用的研究技术[编辑]

蛋白质是细胞功能的主要执行者。在许多情况下,一个细胞功能的实现是多个蛋白质分子相互作用的结果。细胞的生命活动,如细胞的信号转导、基因转录、蛋白转运、蛋白质修饰和降解等,都依赖于蛋白质之间的相互作用。研究蛋白质相互作用是理解细胞生命过程的关键。实验室中常用的蛋白质相互作用研究技术包括免疫沉淀、酵母双杂交等方法。

免疫沉淀可验证蛋白质-蛋白质相互作用[编辑]

免疫沉淀(immuno-precipitation, IP)的主要过程是:首先用耦联在凝胶颗粒或磁珠上的目的蛋白的抗体将细胞匀浆或裂解液中的目的蛋白沉淀出来,在此过程中能够与目的蛋白发生相互作用的蛋白会被同时沉淀下来,然后用SDS-PAGE、免疫印迹或生物质谱对沉淀出来的蛋白进行鉴定。免疫沉淀方法简便易行,是实验室最常用的方法,但是它属于体外(in vitro )实验方法,不能给出细胞内蛋白相互作用的动态结果,同时细胞内本来没有相互作用的蛋白质在破碎细胞时可能发生凝聚,因此免疫共沉淀还存在假阳性的问题。

酵母双杂交用于筛选存在相互作用的蛋白质[编辑]

酵母双杂交(yeast two-hybridization)的基本原理是:将目的蛋白与报告基因的DNA结合结构域构建成融合蛋白[目的蛋白通常称作诱饵(bait)], 将被筛选的蛋白与报告基因的转录激活结构域构建成融合蛋白[被筛选的蛋白通常称作俘获物(prey)],如果目的蛋白和筛选的蛋白在酵母细胞中存在相互作用,则报告基因就会在酵母中进行表达,然后从阳性酵母菌落中分离出阳性蛋白的质粒就可以确定阳性蛋白的编码序列。酵母双杂交能快速检测蛋白相互作用,包括相应的结构域,并找到相应的编码基因,是一种被广泛采用的,在体内(in vivo )条件下研究蛋白质相互作用的方法。但是酵母双杂交只能说明两个蛋白质之间有相互作用的结构基础,并不表示这两个蛋白质在细胞内一定会相遇或这种相互作用在活细胞确实存在,因此酵母双杂交确定的实验结果通常需要用免疫共沉淀进行验证。另外,酵母双杂交只是个筛选系统,并不能直接将蛋白质相互作用与特定的细胞功能联系起来。

噬菌体展示可筛选存在相互作用的蛋白质[编辑]

噬菌体展示(phage display)是一种体外筛选蛋白质与蛋白质相互作用的技术,其基本原理是:将被筛选蛋白与噬菌体的衣壳蛋白构建成融合蛋白,使被筛选蛋白在噬菌体的表面进行表达;然后将目的蛋白固定在平板或小珠上,与展示不同筛选蛋白的噬菌体文库进行孵育;孵育后洗去未结合噬菌体,然后分离特异性结合的噬菌体;分离出的噬菌体经体内扩增,再重复上述结合分离过程,使那些能展示与目的蛋白发生最特异结合的筛选蛋白的噬菌体得到逐步的富集,一般需经过三轮筛选/扩增循环,最后经过DNA测序鉴定所得噬菌体中筛选蛋白的编码基因。与其他技术相比,噬菌体展示技术的主要优点是容易对库容最较大的文库(多样性大于109)进行筛选。

蛋白质与核酸相互作用的研究技术[编辑]

蛋白质与核酸(DNA和RNA)的相互作用是基因表达调控的基础。基因表达调控是细胞对外部或内部刺激发生应答的方式,可以发生在转录水平、转录后水平、翻译水平和翻译后水平。转录水平的调控涉及基因组DNA与一系列结合蛋白的相互作用,也就是多种转录因子与多个基因转录调控区域的特异性结合;而转录后水平和翻译水平的调控涉及多种RNA结合蛋白(RNA binding protein, RBP)参与,也即多种RNA分子与多种RBP之间的特异结合,以完成RNA加工、修饰、转运、定位和降解等过程。掌握DNA与蛋白质、RNA与蛋白质相互作用的研究方法,对深入研究基因表达调控的分子机制有重要帮助。随着基因组学、生物信息学和测序技术的进步,我们已经可以在全基因组水平对细胞的基因表达调控进行分析。

染色质免疫沉淀技术研究DNA与蛋白质相互作用[编辑]

染色质免疫沉淀技术(chromatin immunoprecipitation, ChIP)是一种在体内研究DNA与蛋白质相互作用的方法。其基本过程是:在生理状态用甲醒将细胞内的DNA与蛋白质交联在一起,用适度的超声波处理将交联复合体打断成含500~1OOObp DNA的片段,然后用所要研究的目的蛋白的特异抗体沉淀交联复合体片段,只有与目的蛋白结合的DNA片段才能够被沉淀下来,最后经过去交联和DNA纯化步骤,即可以对与目的蛋白结合的DNA片段进行分析。
同研究DNA与蛋白质相互作用的其他方法相比,如电泳迁移率变动分析(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)、酵母单杂交系统(yeast one-hybrid system) 等,ChIP 是一种体内(in vivo )研究方法,能够捕捉到发生在染色质上的基因表达调控的瞬时事件,反映细胞内基因表达调控的真实情况。
染色质免疫沉淀技术可以用于低通量的研究,如验证某个特定的转录因子能否与某个或多个基因的启动子区域结合,或者验证某个蛋白结合的DNA区域是否是启动子区域等。染色质免疫沉淀也可用于高通量的基因组水平的研究,如以Oct4和Nanog为目的蛋白分别对胚胎干细胞和已分化细胞进行免疫沉淀,然后应用表达谱芯片或高通量测序技术分析获得的DNA片段,可以在全基因组水平发现胚胎干细胞和已分化细胞的基因表达调控的差异和特性。由于抗体可以区分同一蛋白的甲基化、乙酰化、磷酸化等不同的修饰状态,染色质免疫沉淀在以组蛋白修饰为主要内容的表观遗传学研究中有广泛的应用。

紫外交联免疫沉淀研究RNA与RNA结合蛋白相互作用[编辑]

在染色质免疫沉淀的最后步骤中,如果不纯化DNA而是纯化RNA, 逆转录后分析沉淀下来的RNA片段,则可以考察与特定转录因子或组蛋白结合的RNA分子,这种方法适于研究染色质中存在的功能性RNA分子。如果考察整个细胞内与特定RNA结合蛋白(RBP)结合的RNA分子,一般用紫外交联免疫沉淀技术(ultraviolet crosslinking and immunoprecipitation, CLIP)。
CLIP的基本原理是:用254nm紫外线照射使细胞中RNA分子与RNA结合蛋白发生共价结合,以RNA 结合蛋白的特异性抗体将RNA-蛋白质复合体沉淀之后,回收其中的RNA片段,经过逆转录后对RNA 分子进行测序,进而发现RNA分子与RBP分子之间的相互作用关系。应用带有限制性酶切位点和识别序列(barcode)的引物进行逆转录,可以识别出在交联碱基处被截断的cDNA的单核苷酸序列,从而使CLIP的分辨率达到单个碱基水平,即iCLIP (individual nucleotide resolution CLIP)。
CLIP能够在全基因组水平揭示RNA与RNA结合蛋白相互作用,是研究RNA与蛋白相互作用的有力工具。但在实际应用中存在一些不足,如交联效率低、难以区分结合与非结合RNA序列、254nm紫外线照射可诱发细胞DNA损伤并合成新的RBP等。CLIP重要的改良技术之一,光活化核糖核苷增强的交联免疫沉淀技术(photoactivatable ribonucleoside enhanced crosslinking and immunoprecipitation, PAR-CLIP) 可克服以上不足,并能够比较准确地确定RNA分子中与RBP结合的序列。CLIP 通常与高通证测序技术联合应用,称为HITS-CLIP (high-throughput sequencing CLIP) 或CLIP-seq。其测序结果经过生物信息学分析,可深入揭示全基因组水平RNA结合蛋白与RNA分子的调控作用及其生物学意义,极大地促进了细胞基因表达凋控的研究。

生物芯片技术[编辑]

生物芯片(biochip) 是20世纪90年代初期发展起来的一门由生物学、微电子学、物理学、化学和计算机科学等多学科交叉融合而成的高新技术。主要包括基因芯片和蛋白质芯片。
基因芯片(gene chip)技术是一种特殊类型的核酸杂交技术,其特点是,用于杂交的探针被固定在固相支持物(如玻璃片、硅片、硝酸纤维素膜)上,在每个支持物表面固定有大量(通常每平方厘米高于400) 的特定基因片段或寡核苷酸探针,这些探针有规律地排列成二维DNA 阵列,故又称为DNA微阵列芯片(DNA microarray)。基因芯片与带有荧光标记样品DNA分子按碱基配对原理进行杂交,通过检测杂交的荧光强度就可获取样品分子的数量和序列信息。
基因芯片主要技术流程是:芯片的设计与制备,靶基因的标记,芯片杂交,杂交信号检测。芯片的制备主要是应用DNA点样仪将化学合成的寡核苷酸探针或PCR扩增的特异性基因片断点在经特殊处理的固相支持物表面。靶基因的标记通常采用荧光标记法,即在由mRNA反转录成cDNA时,应用荧光素标记其中一种核苷酸,这样便能合成带有荧光素标记的cDNA。例如要检测实验组和对照组中的基因表达变化,如果实验组以红色荧光素标记,则对照组要以绿色荧光素标记。基因芯片与靶基因的杂交和一般的分子杂交过程基本相同,通常是将自等量总RNA或mRNA反转录成的经荧光素标记的实验组和对照组cDNA与一个芯片同时杂交。荧光观察结合计算机进行,如果芯片上的荧光点为黄色,则说明该基因在实验组和对照组中均有表达,并且表达量相同;若荧光点为红色则表明实验组中该基因高表达,荧光点为绿色表明对照组中该基因高表达。
基因芯片技术同时将大量探针固定于支持物上,可对样品中数以千计的核酸序列进行一次性的快速检测和分析,常用于组织细胞的基因表达谱测定、基因多态性与基因突变分析等方面。在基因功能研究中,基因芯片技术常用于筛选候选基因。
蛋白质芯片(protein chip)技术是指将大量蛋白质或多肽固化于固相支持物表面,通过蛋白质-蛋白质间的相互作用(如抗原抗体反应、受体配体识别等),对样品中靶蛋白分子进行高通量检测的一种技术。蛋白质芯片的工作原理与基因芯片类似,也多是把荧光标记的待检样品与芯片上的蛋白质探针反应,洗脱未反应成分后检测特异的反应信号。

蛋白质组学技术[编辑]

蛋白质组(proteome)是指在特定时空条件下某种细胞、组织或器官所含有的全部蛋白质。与此相对应,蛋白质组学(proteomics)是以特定时空条件下某种细胞、组织或器官所含有的全部蛋白质的 存在及其活动方式为研究对象的学科。目前蛋白质组学研究技术已成为确定基因功能的有效手段, 是基因组学研究进入功能基因组时代的主要标志,是功能基因组时代生命科学研究的核心内容。其 中,亚细胞器蛋白质组和器官蛋白质组研究日益成为蛋白质组学研究领域的热点。
蛋白质组学最初应用蛋白质双向电泳和质谱技术研究不同组织细胞中蛋白表达谱,是蛋白质组 学研究的基本技术,在此简要介绍。
来源于细胞或亚细胞结构的蛋白质样品在双向电泳中,先在第一向的高压电场下进行等电聚焦 (IEF), 然后再进行第二向的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。目前等电聚焦电泳采用固相pH梯度 (IPG)胶条,避免了因载体两性电解质引起的聚焦时间延长、pH梯度不稳定、阴极漂移等现象,其分辨率达已到1万多个蛋白质点,但对过于偏酸或偏碱、高分子量、微猷蛋白质、及难溶性蛋白质的分辨仍感困难。由于双向疑胶电泳对批僵蛋白质可实现一次性分离,具有高灵敏度和高分辨率、便于计算机进行图像分析处理、可以很好地与质谱分析等鉴定方法匹配的优点,因而成为目前分离蛋白质组分的核心技术。
基于双向凝胶电泳的蛋白质组研究会产生大量数据,传统的微量蛋白质测序、氨基酸组成分析等 蛋白质鉴定方法费时、费力、不易实现高通量分析。因此一种新的蛋白质鉴定技术——质谱法(mass spectrometry)受到了人们的重视和应用,其基本原理是样品分子离子化后,根据离子间质荷比(m/z)的差异来分离并确定样品的分子质量。目前用于蛋白质鉴定的质谱主要有两种:电喷雾电离质谱(electrospray ionization mass spectrometry, ESI-MS)和基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization/time-of-flight, MALDI-TOF-MS)。蛋白质的质谱测序通常借助串联质谱(tandem mass spectrometry, MS/MS), 即质谱联用技术,测定肽片段的序列结构。串联质谱将每个酶解短肽经第一级质谱或色谱分离进入碰撞室,与氮气或氨气碰撞,沿着碳骨架断成不同长度的寡肤;第二级质谱测定由第一级质谱产生的寡肽的分子质量,一系列寡肽的分子质量差异对照各种氨基酸残基的分子质量,如此对号入座即可解读出肽段的氨基酸序列。串联质谱在测定氨基酸序列方面具有灵敏度高、耗时短、样品不需纯化的特点。

高通量测序技术[编辑]

高通量测序技术堪称DNA序列分析技术发展历程的一个里程碑。该技术可以对数百万个DNA分子进行同时测序,这使得对一个物种或个体的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能,因此 也将其称为深度测序(deep sequencing)或下一代测序技术(next generation sequencing, NGS)。为便于理解和应用,在此首先介绍常规的DNA测序方法。
DNA常规测序的原理,是基于F.Sanger建立的双脱氧链末端合成终止法。即在以单链DNA为模板的DNA合成反应体系中,利用一定比例的4种3'-双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)代替部分脱氧核苷三磷酸(dNTP)作为底物,一旦双脱氧核苷三磷酸掺入到合成的DNA链时,由于核糖的3'位碳原子上不含羟基,无法与下一个核背酸反应形成磷酸二酯键,导致正在延伸的DNA终止。目前最常应用的是四色荧光自动化测序技术。用4种发出不同颜色荧光的荧光素分别标记4种ddNTP, 以一定的比例与4种无标记dNTP混合,在同一反应管中用单向引物进行DNA延伸反应,带荧光素标记的某一3'-双脱氧核苷三磷酸在掺入DNA片段导致合成终止的同时,使该片段3'端标上了这种特定的荧光素。同一反应管中大量的模板DNA经过20~30循环的单向延伸反应,最终会产生许多仅相差一个单核苷酸的不同长度的单链DNA片段混合物,每个DNA片段3'末端的最后一个ddNTP, 决定了该片段发出的荧光颜色。每一管中混合存在的不同长度的单链反应产物可以通过凝胶电泳在同一个泳道有效分开。检测器的激光束在凝胶的底部附近检测并记录通过泳道的每一条带所标记的荧光颜色,计算机阅读这四种颜色后得到并存储核酸序列。
与常规的DNA测序方法相比,高通量测序的原理是将DNA固定在芯片上,测序反应以大规模阵列形式排列,边合成边测序,不依赖于电泳,阵列上DNA合成时的单个碱基改变所发出的荧光信号被检测器捕获并转化为一个测序峰值,从而获得序列信息。荧光信号可以由被荧光标记的dNTP产生,也可以由DNA合成时所触发的酶催化底物激发出的荧光形成。目前应用的高通量测序技术以Roche公司的454焦磷酸测序技术、Illumina公司的Solexa聚合酶合成测序技术和ABI公司的SOLiD连接酶测序技术为主,这些技术在测序开始时,均需要基于PCR扩增的信号放大过程。新近发展起来的以对单分子DNA进行测序(非PCR扩增)的技术,真正达到了读取单分子荧光的能力。
高通量测序技术的实际应用价值是与其他基因组水平研究技术的联合。例如,高通量测序技术与转录组技术结合,可进行高通量的RNA测序,即RNA-seq。通过对同一样品转录组的深度测序可以捕获低表达的基因,而对大量样品同时测序可以获得样品之间的表达差异。高通量测序技术与 ChIP联合,形成ChIP-seq技术;与基因组甲基化检测技术结合,形成Methyl-seq技术;与CLIP技术结合,形成CLIP-seq技术。联合应用RNA-seq、ChIP-seq、Methyl-seq、CLIP-seq, 再应用有效的生物信息学方法,对获得的数据进行深入分析,可大大加深我们对复杂基因调控系统的网络结构和相互作用方式的认识。高通量测序技术使得单细胞测序技术成为可能。

单细胞测序技术[编辑]

是在单细胞水平对全基因组或转录组等进行扩增与测序的一项新技术。其原理是将分离的单个细胞的微量全基因组DNA或转录组RNA进行扩增,获得高覆盖率的完整的基因组或转录组后进行高通量测序,用于揭示细胞群体的时空差异和细胞进化关系等。
每个细胞都是独一无二的,但我们之前的研究对象往往是细胞群体,忽略了这些细胞之间的异质性。正因如此,单细胞基因组学和转录组学研究受到了越来越多的关注。
一个细胞里的DNA或RNA仅仅处在皮克(picograms)级的水平,这么少的量远远达不到现有测序仪的最低上样需求。因此科学家们必须先对单细胞内的微量核酸分子进行扩增,而且必须保证尽可能少地出现技术误差,以便开展后续的测序及其他研究。
单细胞测序技术取得突破主要与下面几个方面有关:技术进步使全基因组及转录组扩增的效率大幅度提高;高通量测序技术使得测序的效率更高,成本更低;微流体技术(microfluidics)或微孔板技术(microwell technology)以及更高精密的荧光活化细胞分选技术(fluorescence-activated cell sorting)等高效分离单细胞技术的不断涌现。
使用单细胞测序技术,能够解决:①样本珍贵,能够利用的材料稀少的问题;②揭示出每一个细胞 的基因组都是独一无二的,同一样组织本中的单细胞基因组存在异质性;③单细胞的基因组可以随着时间和空间进行随机的改变。单细胞测序技术在医学领域里也有着广泛的应用前景,比如各种肿瘤和许多疾病的研究和诊断,孕妇胎儿的产前诊断等。

模式动物个体水平的基因操作技术[编辑]

在细胞生物学研究中,除开展大量的体外(in vitro )实验研究之外,特别强调体内(in vivo )研究结果的价值。体内研究主要在模式动物上进行。生物医学研究中常用的模式动物有果蝇(Drosophila)、秀丽隐杆线虫(C. elegans)、斑马鱼(Zebrafish)、爪蟾(Xenopus)和小鼠等。基于模式动物个体水平的基因操作技术,特别是基因敲除(gene knock-out)技术在细胞的功能性基因研究中非常重要。
小鼠与医学的关系极为密切。研究基因的功能,常需要在小鼠中引入一个额外的基因或对基因进行改变,来观察其效应。进行这种基因操作的小鼠被称为转基因(transgenic)小鼠。目前用于制备转基因小鼠的主要方法有两种,一是把待研究的基因DNA直接注射到受精卵的细胞核中;另一是在培养的胚胎干细胞(embryonic stem cell, ES细胞)基因组中改变或者加入一个基因,随后把有基因改变的ES细胞注入胚泡,使其成为内细胞团的一部分。后者是基因敲除的常用方法。
可以通过同源重组(homologous recombination)的方法,使导入ES细胞的外源性载体DNA插入到一个特定的预定位点。同源重组是两个DNA分子在某相似序列的特定位点上的重组。因此,导入的DNA 必须包含足够的靶基因同源序列,才能保证其至少在一小部分培养的细胞基因组中的预定位点插入外源性基因。这些带有特定基因突变或缺失的ES 细胞被导入胚泡的内细胞团之后,在小鼠的后 代中将产生一个携带特定基因突变或缺失的转基因小鼠。一般地,通过这种方法获得的Fl代小鼠通常为嵌合体。一旦突变基因进入生殖细胞,突变小鼠的杂合子可以通过杂交产生纯合体,当小鼠是失活基因纯合体的时候就称为基因敲除。由此,基因敲除被定义为利用DNA同源重组原理、借助于遗传操作手段使有机体的某一特有基因完全失活。通过观察基因敲除后动物的表型,即可明确基因的功能。
CRISPR/Cas9基因编辑及相关技术的出现和发展,使得在胚胎干细胞基因组中敲除或者加入一个基因更加简易和高效。
基因改变的杂合子小鼠通过杂交可产生能存活的纯合体或纯合致死体。胎死腹中的小鼠难以观察到表型,事实上一个基因可以在个体多种组织中甚至是不同发育时期表达。因此,为研究基因的特定功能,需要在特定组织和(或)在发育的特定时间里敲除靶基因。这种性质的基因敲除可通过Cre-loxP 系统实现。靶基因首先被插入到两个loxP 序列(有34个碱基对)之间,把这个基因的转基因小鼠与另一个品系的携带Cre重组酶的转基因小鼠交配,loxP 序列被Cre识别,2个loxP 位点之间的所有DNA被切除。在小鼠后代中,如果Cre在所有的细胞中表达,那么所有细胞的靶基因均被切除。然而,如果Cre基因的表达受控于组织特异性启动子,例如,它只在心脏组织中表达,靶基因将只在心脏组织中被切除,造成靶基因只在心脏组织中被敲除。如果Cre基因被连在可诱导的启动子控制区之下,可以通过将小鼠暴露于诱导刺激条件下,随时切除靶基因。
尚须指出的是,很多单基因敲除的小鼠没有明显的表型异常或产生比预期少而轻的异常,这说明其他基因可以代替敲除基因的一些功能。
基因敲除技术在一般实验室中难以达到,通常是从专业实验室订购。在获得基因敲除鼠之后特别是在后续的小鼠杂交过程中,常需要对后代小鼠进行验证。主要的验证或鉴定方法是PCR和Southern印迹杂交(Southern blot)。Southern印迹杂交技术是检测基因组中特异DNA序列的方法:提取的DNA分子用一种或几种限制性内切酶消化成若干片段、并在琼脂糖凝胶电泳上分离,然后将变性处理后的凝胶中的单链核酸序列片段转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜上,将印迹有单链核酸序列片段的硝酸纤维素膜或尼龙膜与目的基因探针杂交,通过显影观察条带的大小,就可对基因敲除小鼠的基因突变或缺失等进行鉴定。