细胞生物学/细胞化学和细胞内分子示踪技术

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细胞生物学研究方法 - 显微技术 - 细胞的分离和培养 - 细胞组分的分离和纯化技术 - 细胞化学和细胞内分子示踪技术 - 细胞功能基因组学研究技术
形态与功能相结合是细胞生物学研究的突出特点,显示细胞内大分子、小分子甚至是无机离子在细胞内分布的分子示踪技术对细胞生物学的研究尤为重要。目前实验室普遍应用的细胞内分子示踪技术是基于光镜和电镜的细胞化学技术。细胞化学技术(cytochemistry technique)是一类将细胞形态观察和组分分析相结合的分析方法,是在保持组织原有结构的情况下利用生物大分子、小分子、无机离子的物理、化学特性来研究它们在细胞内的分布、数量及动态变化,包括酶细胞化学技术、免疫细胞化学技术、原位杂交技术、放射自显影技术等。随着检测分析仪器的进步和以荧光染料为代表的活体染料的广泛使用,细胞内的分子示踪技术已经能够对活细胞内的分子进行实时的动态观察。

酶细胞化学技术[编辑]

酶是细胞绝大多数生命活动过程的最终执行分子,细胞内各种酶的分布和活性变化,如蛋白激酶、蛋白酶、过氧化物酶等,反映了细胞的生理状态和病理状态的变化。酶细胞化学技术(Enzyme cytochemisl1y)就是通过酶对特异底物的反应并显色来检测酶在器官、组织和细胞内的分布及酶活性强弱的一种技术。酶细胞化学反应的基本原理是将酶与其底物共同孵育,然后使产物与显色剂反应生成荧光分子、有色可溶性化合物、有色沉淀或高电子密度沉淀,最后通过光度计、光镜、电镜等进行检测和观察。

免疫细胞化学技术[编辑]

抗体对抗原的严格特异性使之成为细胞生物学的一种有力工具。免疫细胞化学技术(immunocytochemistry, ICC)是利用免疫学中抗原抗体特异性结合的原理来定性和定位研究器官、组织和细胞中的生物活性大分子的技术。用荧光染料标记的抗体,在荧光显微镜下,可以对细胞中的特殊分子进行定位。将电子密度高的胶体金标记抗体,则可在电镜下高分辨观察特定分子的分布情况。为了提高检测其灵敏度,可以将荧光物质或酶类标记与一级抗体结合的抗体(二级抗体),而不是标记与抗原直接反应的抗体(一级抗体)。每个一级抗体上可以结合多个二级抗体,因此进行荧光检测或酶与底 物的显色反应,可大大增加信号的强度。

放射自显影技术[编辑]

天然存在的元素,大多是同位素的混合物。同位素间尽管核重量不同,但核外电子数相同,化学性质也相同。放射性同位素(radioisotope)的核不稳定,随机衰变成为另一种原子的同时,释放出β或γ射线。放射性同位素很少天然存在,需在原子炉中用高能粒子轰击原子产生。生物学研究中常用的放射性同位素有32P、131I、35S、14C、45Ca、3H等。放射线可以用几种不同方法检测。如果是β粒子可以用盖革计数器或液体闪烁计数器定量计数。常常用这种方法对生物样品中放射性同位素标记的某种分子进行定性或定量检测。
放射性自显影技术(autoradiography)是用放射性同位素标记生物样品中的大分子或其前体物质,然后通过乳胶感光(卤化银还原成为银原子),显示出被标记物在组织和细胞内的位置、数量及其变化。在放射性同位素实验中常用的35S、14C、3H是弱放射性同位素,32P是强放射性同位素。实验中常以3H-亮氨酸和35S蛋氨酸标记蛋白质,用3H-岩藻糖和3H-甘露醇标记糖类,3H-胸腺嘧啶脱氧核苷、3H-胸苷或3H-尿苷标记核酸。放射性自显影技术的具体操作步骤是:首先,用注射、掺入、脉冲标记等方法将放射性化合物渗入活细胞,培养不同时间后取样固定,制备光、电镜切片;在暗盒中把感光乳胶裂盖在切片上存放数日。由于放射性同位素衰变使乳胶感光(自显影过程),经过显影和定影,根据银盐颗粒所在位置即可知道细胞中放射性物质的分布情况。例如,用放射性前体3H-胸苷,3H-尿苷分别脉冲渗入培养细胞,显示DNA是在细胞核中合成并保留在核内,而RNA最初在细胞核内合成,然后很快积累于细胞质中。放射自显影是一种很灵敏的技术,在适宜的条件下几乎能检测出放射性原子的每次衰变,在细胞生物学研究领域中曾经发挥并且还在发挥着重要的作用。

活细胞内分子示踪[编辑]

普通的细胞化学技术虽然能反映出细胞内生物分子的存在位置及其与细胞功能的关系,但这种技术在应用过程中通常是观察固定后的细胞内的分子分布情况,与活细胞中分子的分布存在一定距离。活细胞内的分子示踪则克服了这一缺点,近些年来被广泛应用于细胞的生理功能研究。

离子探针进行细胞内离子的实时检测[编辑]

细胞内离子有着重要的生理功能,它们有的是信号转导的信使(如钙离子),有的是酶催化所必需的(如钠、钾、钙、镁、铜、铁、锌、猛等离子),有的通过离子通道跨膜转运影响膜电位(如钠、钾等离子),有的则促进膜的融合(如钙离子)。细胞内离子的实时检测将揭示一些生理过程的机制。一些染料专一地与某种离子结合后会产生荧光或改变本身荧光的发射波长与强度,从而通过荧光检测可以显示该离子的量。通常称这些染料为离子探针。如果将它们导入细胞内,就能在时间与空间上显示活细胞内某种离子的动态变化。

绿色荧光蛋白常被用于显示特定蛋白质在细胞内的定位[编辑]

绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)是应用最广泛的研究蛋白质亚细胞内定位的报告分子。GFP最初从水母中分离,含有238个氨基酸残基,是一种构象很稳定的蛋白质。它不含辅基,也不需要辅助因子,在蓝色光源(450~490nm)的激发下,发射出绿色荧光(520nm)。GFP基因可以很容易地导入到其他种类的细胞当中去表达。构建绿色荧光蛋白基因与目的蛋白基因的融合基因表达载体,转染特定的细胞,可以在荧光显微镜或者是共聚焦显微镜下观察目的蛋白质在细胞内的位置及随时间变化情况。
在大部分情况下,所表达的融合蛋白的状态是由目的蛋白决定的,也就是说融合蛋白中的GFP仅仅是一个标记物,不影响另一部分目的蛋白在细胞内的真实定位。
通过点突变的方法研究GFP的结构与功能,发现一些突变蛋白的光吸收与荧光行为发生改变,由此开发出多种不同颜色"GFP"。目前常用的有不同激发光与发射光谱的"GFP"包括GFP、黄色荧光蛋白(YFP)、青色荧光蛋白(CFP)、蓝色荧光蛋白(BFP)等。此外还有相应的荧光强度较大的增强绿色荧光蛋白(EGFP)、增强黄色荧光蛋白(EYFP)、增强青色荧光蛋白(ECFP)等,其中EGFP与GFP的不同在于有F64L和S65T两个点突变。
细胞的信号传递过程、酶的失活或激活过程、受体和配体的结合等重要的分子事件都依赖于蛋白与蛋白的相互作用。虽然GFP的融合蛋白能够提供许多信息,也可以研究几种蛋白质的细胞内共定位,但不能给出蛋白与蛋白有直接相互作用的证据。此时,荧光共振能量转移就有了广泛应用。

荧光共振能量转移可实时观察细胞内蛋白质与蛋白质相互作用[编辑]

细胞内蛋白质发挥功能的主要方式之一是不同蛋白质之间的相互作用并形成复合物,荧光共振能量转移是检测蛋白质之间相互作用的新方法。荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)是一种量子力学现象,当一个荧光供体与一个荧光受体分子彼此接近而供体的发射光谱与受体的激发光谱重叠时就会发生FRET现象,此时能量以非辐射的方式由供体转移到受体。其直观表现是:供体荧光和受体荧光之间靠近达到合适的距离时,如果以供体的激发光激发,供体的荧光强度则比它单独存在时要低得多。目前常用的FRET荧光染料对主要有Cy3-Cy5、Alexa546-Alexa647和Texas Red-Tetramethylrhodamine等;而供体和受体均为荧光蛋白的包括CFP-YFP、BFP-EGFP等。
细胞生物学中早期FRET的研究多以生物分子的荧光类似物或在生物大分子上以共价或非共价方式偶联上一个荧光基团作为荧光供体或受体。在把GFP引入到基于FRET的显微映象研究后,可以实时观察细胞内蛋白与蛋白相互作用、生物大分子构象变化,极大地促进了细胞内实时反映动态分子过程的研究。

单分子示踪是研究活细胞内大分子行为及功能的重要方法[编辑]

单分子荧光成像(single molecule fluorescence imaging)和原子力显微镜是活细胞体系中单分子研究的两种核心技术。
单分子荧光成像具有较高的时间分辨率,对细胞在生理活性条件下的检测比其他技术更为成熟,是目前用于活细胞中单分子研究的最重要的一种方法。与普通荧光技术相比,单分子荧光成像技术具有样品激发范围小、光子收集效率高、采用高量子产量高信噪比荧光基团及低本底荧光的特点。目前单分子荧光成像技术可以采用全内反式荧光显微镜(total internal reflection fluorescence microscope, TIRFM)和共焦激光扫描显微镜进行成像。目前已报道的活细胞单分子荧光成像在细胞生物学研究中的应用包括研究配体与受体的结合、蛋白质的聚合和解聚、蛋白、mRNA等生物大分子的动力学行为及蛋白、病毒的示踪等。
原子力显微镜能够在溶液和室温下进行操作,分辨率高,非常适合于在生理条件下显示生物分子的特异性相互作用。实现活细胞中分子(如受体-配体)的相互作用的单分子力测量一直是原子力显微镜的应用目标,但目前存在的困难有:细胞固有弹性的影响,目标分子易于从细胞膜上拉下来,受体-配体密度过低而难形成有效的相互作用,影响测力因素过多导致结果难以解释,以及针尖易被污染等。因此,尽管在单分子水平上的研究很多,但是真正在活细胞上实现的很少。近几年来,在活细胞原子力测量方面不断出现新的成果,主要集中在血液凝集、白细胞黏附等细胞黏附性质的研究上。
尽管活细胞单分子行为的研究目前仍处于起步和探索性阶段,其应用还主要限于简单的分子以及已经研究的比较成熟的简单生物学问题,但是不难看出活细胞单分子行为及实时检测研究是生命科学向微观世界深入探索的一个重要标志。