细胞生物学/细胞的分离和培养

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细胞生物学研究方法 - 显微技术 - 细胞的分离和培养 - 细胞组分的分离和纯化技术 - 细胞化学和细胞内分子示踪技术 - 细胞功能基因组学研究技术
几乎所有高等生物(包括动物和人)的组织都是由许多种不同类型细胞组成的。了解某一种细胞的生命活动过程,常需要大量的同一种细胞。这就要求从组织中分离和纯化目的细胞,并能够在体外进行培养。细胞的分离和培养是细胞生物学的基本研究技术,也是细胞生物学前沿领域(如干细胞、细胞工程等)研究和应用的实验基础。

不同类型细胞的分离[编辑]

利用细胞的物理学和生物学特性以及实验目的的不同,可将目的细胞从实体或悬液组织中分离出来。从实体组织中分离活细胞的第一步是将组织制备成游离的细胞悬液。通常将组织剪成小块,然后联合或独立应用机械方法(如细切、通过筛网、用力吹打等)和酶解方法,即可得到游离细胞悬液。
酶解方法主要是用胰蛋白酶、胶原酶消除细胞间的连接和细胞外基质,用金属离子鳌合剂(如EDTA和EGTA)除去细胞黏着所依赖的钙离子。酶解方法在操作过程中必须遴守以下基本原则:①分离体系所用的溶液必须是等渗的,要具有缓冲性的离子强度;②分离体系应保持低温,以降低细胞的代谢活动;③无菌操作,以备进一步用于细胞培养和分离纯化某些成分;④所用的试剂、器皿需要高压灭菌或过滤除菌。

利用细胞的物理和生物学特性可简单有效地分离和筛选细胞[编辑]

有些类型的细胞只有黏着在培养皿表面才能进行良好的生长和增殖;有些细胞不需黏附在培养皿表面,而只是悬浮在培养基中就可以进行良好地生长增殖,即细胞具有贴壁或悬浮生长的特性。利用贴壁生长的特性,可以有效地将上皮、内皮、成纤维、骨骼肌等类型的细胞与血液细胞和操作过程中形成的死细胞分离;利用细胞悬浮生长的特性可以有效地分离出生长于血液、腹水或胸水等悬液组织中的细胞。
利用细胞的密度特性也可有效分离不同的细胞。血浆白蛋白使血浆具有一定的黏稠度和密度,是一种天然的密度介质。外周血中的白细胞密度介于血浆和红细胞之间。2500g离心10分钟即可将外周血分成三层,白细胞层位于血浆层(上层)和红细胞层(下层)之间,从而将白细胞分离。在离心力的作用下,细胞可沉降于与自身密度相同的密度平衡点。因此,使用能够形成精细密度梯度的介质,如Percoll(胶体硅)等,可对密度差异较小的细胞进行精细分离。
分离细胞不一定需要复杂的设备,综合利用细胞本身的物理和生物学特性能够对某些特定类型的细胞进行有效分离。一般来说分离细胞采用的步骤越少,越能提高细胞的存活率和分离产量,并保护细胞原本的生活状态。此外,选择性培养和克隆化培养也是精细分离不同类型细胞的有效手段。

流式细胞术精确分选荧光标记的细胞[编辑]

流式细胞仪(flow cytometer), 也称荧光激活细胞分选仪(fluorescence activated cell sorter, FACS)是从多细胞悬液中分离目的细胞的精密仪器。流式细胞仪一般由液流系统、激光发器件、信号检测和控制系统四部分组成。通常用氢离子激光发出的激光束为激发光,通过调节液压,迫使悬浮细胞排成单列,按重力方向流动,当细胞通过激光束检测区时,细胞被激光束照射而向各个方向发出散射光,若经荧光染色的细胞,就会发出一定强度的荧光。仪器的检测系统可逐个对细胞的散射光和荧光强度进行测定,并将测得的光信号转变成电信号,由电子控制台放大和显示。因此,流式细胞仪具有更广泛的用途。在用于细胞分离上,其特点是用带有荧光的特异抗体标记待分离的细胞,然后在流式细胞仪中从未标记的细胞中分选出标记细胞。当一个有荧光抗体标记的细胞液滴通过激光检测器时,将被带上负电,不含荧光标记的细胞被带上正电,这些带电细胞液滴通过电场时将偏离原来流动的方向,分别收集带正、负电荷的细胞即可得到想要分离的细胞。流式细胞仪可以每秒2万个的速度对细胞进行分选,其纯度可超过95%。

免疫磁珠法可获得高纯度细胞[编辑]

免疫磁珠(immunomagnetic microsphere)是一种人工合成的内含磁性氧化物核心的免疫微球颗粒,其中心是Fe2O3或Fe3O4颗粒,外包一层聚苯乙烯或聚氯乙烯等高分子材料。在外部磁场作用下,磁性微球可迅速从介质中分离出来,当外部磁场撤离后,微球又可重悬于介质中。由于微球的外表面为聚乙烯性质的高分子材料,很容易包被不同类型的单克隆抗体。因此利用带有特定单抗的免疫磁珠与靶细胞特异结合的特点,能快速地从多细胞悬液中将目的细胞分离出来。在操作过程中,首先将待分离细胞与包被有特定单抗的免疫磁珠混合孵育,并将分离柱安装于磁场中,然后将磁珠-细胞混合液缓慢过柱,此时在柱外磁场的作用下,与磁珠结合的细胞被磁场吸附,未结合的细胞从柱中流出, 进一步洗去未结合的细胞后,去除磁场,回收目的细胞。免疫磁珠法操作简便,特异性强,具有很好的细胞回收率,同时磁珠颗粒对细胞无影响。连续两次过柱分选可进一步提高分选细胞纯度,通常可达95%~99%。

激光捕获显微切割技术能从组织切片中精确分离单一细胞[编辑]

激光捕获显微切割技术(Laser capture microdissection, LCM)虽然不能用于分离活细胞,但其突出优点是能够从组织切片中精确地分离单一的细胞。其一般过程是:制备组织切片(通常是冰冻切片),在显微镜下将组织切片覆以特制的透明薄膜,用激光束切割所需的细胞区域,覆膜在激光束经过的地方被溶化,并与下面的细胞紧密连在一起,然后再用另一激光束将其弹出到细胞收集管。分离的细胞可用于生化与基因组分析等研究。激光捕获显微切割技术将形态学观察与分子水平研究有机结合起来,特别适用于待分离细胞在组织(切片)中的数量较少或呈散在分布的情况。目前迅速发展的激光捕获显微切割技术正在与高通量的基因芯片技术结合,将在生物医学领域中得到广泛应用。

细胞培养[编辑]

细胞培养(cell culture)是指细胞在体外的培养技术,即无菌条件下,从机体中取出组织或细胞,模拟机体内正常生理状态下生存的基本条件,让它在培养器皿中继续生存、生长和繁殖的方法。通过细胞培养可以获得大量的、性状相同的细胞,以便于研究细胞的形态结构、化学组成及功能和机制。

细胞培养的全过程必须在无菌的环境下进行[编辑]

细胞培养的全过程必须在无菌的环境下进行。为避免环境中的微生物及其他有害物质的影响,需要特殊的无菌室。无菌室应包括操作间和缓冲间两部分。操作间要求有供无菌操作的超净工作台、观察培养细胞的倒置显微镜、离心细胞的小型离心机、及复苏细胞和预热培养基的水浴锅等。培养细胞所需要的氧和二氧化碳由接有二氧化碳钢瓶的培养箱提供。培养箱中充填二氧化碳的目的是用来缓冲和维持细胞培养基的pH,提供适宜细胞生长的酸碱度。细胞生长的营养物质由培养基供给。目前常用基础培养基有Eagle氏培养基、RPMl-1640、DMEM及Fl2培养基等。这些基础培养基虽然组成不尽一致,但都含有细胞所需要的氨基酸、维生素和微温元素等成分。基础培养基只能提供细胞生长的简单营养物质,细胞实际培养时,还需要添加一些天然的生物成分,其中主要是血清。血清含有许多生长因子,促进细胞贴壁和增殖。不同的细胞培养需要选择不同的培养基。

细胞培养的主要方式是原代与传代培养[编辑]

体外培养的细胞可分为原代细胞和传代细胞。直接从体内获取的组织或细胞进行首次培养为原代培养(primary culture); 当原代细胞经增殖达到一定密度后,将细胞分散,从一个培养器以一定比例移到另一个或几个容器中的扩大培养,为传代培养 (secondary culture)。传一次习惯上就称为一代。用这种方法可以重复传代数周、数月以至数年。但若反复传代,不仅会消耗大量的培养皿和培养基,而且传代次数的增加、在体外环境中的生长时间过长也会引起细胞特性的逐渐变化,特别是大部分组织来源的细胞不能在体外“永生”,因此,需要将培养的细胞及时冷冻在-196℃的液氮中长期保存,待需要时将细胞复苏后再培养。

来源于体内的细胞可以在体外建系[编辑]

多数原代培养的脊椎动物细胞,在体外经过有限次数的传代培养之后就会死亡。来源于人和动物正常组织的细胞,在体外传代次数一般不超过50代。例如,从胎儿中分离到的成纤维细胞可传50代,来源于成人肺组织的成纤维细胞只能传20余代。通常来源于恶性肿瘤组织的细胞能够在体外无限繁殖、传代,称为细胞系(cell line)。例如来源于宫颈癌组织的HeLa细胞系,于1951年建立,至今仍在世界各地的实验室应用,成为“永生”细胞。正常组织培养的细胞在某些特殊条件下,如放射线照射、化学致癌物处理或癌基因转染等,也能形成“不死”的变异细胞,成为具有肿瘤细胞系性质的细胞。
在细胞建系过程中,无论是自肿瘤组织中分离的细胞,还是正常组织细胞经特殊诱导后产生的“不死”细胞,均需对其生物学特性加以鉴定。还可以用细胞克隆化(cloning)的方法进一步改善细胞系的均一性,即分离出单个细胞使之增殖形成细胞群(colony)。由此产生的细胞群称为细胞株(cell strain),它来源于一个克隆(clone), 是个具有相同性质或特征的培养细胞群体。
迄今世界上所建立的各种能连续传代的细胞系和细胞株达5000余种。许多国家的研究机构均设有细胞库,随时可以供研究者使用。

培养中的细胞是细胞行为研究的主要模型[编辑]

培养的细胞能够比较完整地保留和展示细胞生长、增殖、运动、黏着、通讯、分化、死亡等生理活动,是在体外研究细胞行为的主要模型。例如,细胞癌变后通常伴有增殖能力、转移能力的提高,这些能力在体外培养的条件下同样可以保持下来。将适当数目的细胞在含有软琼脂的培养基中培养,计数形成集落的个数,可以考察细胞增殖能力的变化;测定体外培养细胞线粒体琥珀酸脱氢酶活性,同样也可考察细胞增殖能力的变化;利用底层膜由细胞外基质成分构成的嵌套小室(transwell), 可以考察细胞侵袭和转移能力的变化,transwell同样可以考察细胞彼此之间的相互作用。