细胞生物学/细胞组分的分离和纯化技术

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细胞生物学研究方法 - 显微技术 - 细胞的分离和培养 - 细胞组分的分离和纯化技术 - 细胞化学和细胞内分子示踪技术 - 细胞功能基因组学研究技术
细胞生物学研究经常涉及对细胞器或分子进行功能分析,但细胞器或功能分子总是存在与细胞内部的多种结构或混合成分之中,因此需要对细胞器和功能分子进行分级分离。

细胞裂解[编辑]

由于细胞外膜和内膜的分隔作用,使人们不能直接获得亚细胞结构和功能分子,需要进行细胞裂解。细胞裂解导致的渗透压变化及多种水解酶的释放,能够破坏细胞器,失活甚至降解细胞的功能分子,因此需在裂解液中加入渗透压维持剂和蛋白酶抑制剂等成分。尽可能保护各种亚细胞结构固有的功能和细胞功能分子的活性,是细胞裂解的基本原则。
使用物理的方法裂解细胞可以避免损伤亚细胞结构,如低渗透压、超声振荡、强制通过微孔、机械破碎或研磨等。这些方法使细胞膜及内质网膜等破裂成为断片,断片立即自我封闭形成小泡,而细胞内的各种亚细胞结构如细胞核、高尔基复合体、线粒体、溶酶体、过氧化物酶体等基本不受损伤。常常把由内质网形成的小泡称做微粒体(microsome)。这些膜性成分与细胞的蛋白、核酸、多糖、离子等功能性分子悬浮在细胞裂解液中,形成浓稠的匀浆(homogenate)。
去垢剂能够溶解细胞的膜性结构,并且破坏蛋白分子之间的疏水相互作用,提高蛋白的溶解性,常用于细胞裂解。去垢剂包括离子型(如阴离子去垢剂十二烷基磺酸钠,SOS)、非离子型(如TritonX-100 和NP-40)和兼性离子型(如CHAPS)等几类。离子型去垢剂对膜的溶解作用强,细胞裂解充分,但易引起蛋白质变性;非离子型去垢剂作用温和,对细胞裂解不彻底,但在适当浓度下可以选择性地抽提细胞质蛋白;非离子型和兼性离子型去垢剂不影响蛋白的等电点,常用于双向电泳样品制备中。一般根据样品来源和实验目的的不同,单独或联合使用多种类型的去垢剂。
尿素、盐酸肌、异硫氰酸胍等离液剂(chaotropic agent)也广泛应用于细胞裂解。但它们对蛋白和膜脂具有较强的变性作用,常用于无需保持蛋白活性的样品制备和细胞DNA和RNA的抽提中。

细胞器及细胞组分的分级分离[编辑]

离心方法是分离提取亚细胞结构和功能分子的重要手段。利用细胞内各种颗粒成分的大小、形状和密度不同,采用差速离心或密度梯度离心的方法将其分离。蛋白、核酸等细胞的功能分子存在于亚细胞结构的基质或细胞匀浆离心后形成的上清中,可利用层析技术或离心技术进一步分离纯化。电泳技术可对分离纯化得到的终产物进行初步的鉴定。

差速离心分离体积、质量差别较大的颗粒[编辑]

差速离心法(differential centrifugation)是分离细胞核、线粒体等亚细胞结构常用的方法。在密度均一的介质中,颗粒沉降速度与其直径成正比,颗粒越大沉降越快。低速离心时,大的组分如细胞核和没破坏的细胞很快沉降,在离心管底部形成小的沉降团块;在较高速度时,线粒体沉降成块;在更高速度加长时间离心,可以先收集封闭小泡,然后收集核糖体。
由于离心沉降前,各种颗粒在介质中是均匀分布的,因而某些慢沉降颗粒被裹到快沉降颗粒的沉降块中,如此分级分离所得到的分离组分纯度不高,再次悬浮小沉降块中的组分,反复离心可去掉杂质而纯化。
应用物理的方法,在等渗缓冲液中裂解细胞,离心后获得的细胞匀浆中含有膜性结构完整的细胞器。这些细胞器的表面分布有特异性的蛋白,如位于线粒体外膜参与蛋白转运的TOMM22,过氧化物酶体表面参与蛋白转运的PM70。利用能够识别这些标志的磁珠(magnetic beads), 无需高速离心,即可将膜性细胞器从细胞匀浆中方便地分离出来。
用100 OOOg将细胞匀浆超速离心,可以将各种细胞器及微粒体沉降下来,上清部分即包含分布于细胞内细胞器之间的液相成分,即细胞质溶胶(cytosol)。细胞质溶胶是细胞内蛋白质合成及其他主要生化反应的场所,含有RNA及大量的蛋白。

速度沉降分离沉降系数不同的颗粒[编辑]

上述差速离心只能将那些大小显著不同的成分分开。速度沉降(velocity sedimentation)则可进行更精细的分离。分离方法是在离心管中加入稀盐溶液,将细胞的抽提液在盐溶液上覆一薄层。为防止对流混合,在离心管中制备由顶部到底部逐渐增加的庶糖溶液的密度梯度(通常5%~20%)。离心后混合物中的各成分以不同的速度沉降,形成不同的沉降带,各沉降带可分别收集。不同组分的沉降速率取决于它们的大小与形状,通常用沉降系数(s)值表示。许多细胞组分,如蛋白质和核酸的沉降系数在1~200S之间。目前超速离心机的转速可以达到85 000转/分,产生的离心力为重力的600 000倍。在这样巨大的离心力下,即使较小的生物分子,如tRNA分子和简单的酶分子都可根据它们的大小将其分开。
超速离心法可以根据生物大分子的沉降系数较精确的测定其分子量。

平衡沉降分离密度不同的颗粒[编辑]

另一种精密的超速离心分离方法是平衡沉降(equilibrium sedimentation)法,它取决于细胞成分的浮力密度,与大小形状无关。平衡沉降方法是在离心管中制备由顶部到底部高浓度差的庶糖或氯化铯(cesium chloride)溶液密度梯度,可把细胞匀浆均匀分布在庶糖或氯化铯介质中后超速离心。匀浆中的不同组分沉降至与自身等密度处时不再移动,形成沉降带,各沉降带再分别收集。用这种方法可以将摄入与未摄入同位素13C或15N的同一种生物分子离心分开。用氯化铯制备密度梯度,进行平衡沉降方法1957年被开发,因分离细菌中15N标记DNA与非标记DNA而直接证明了DNA是半保留复制,使这一实验成为历史性的实验。

非细胞体系有助于确定各种细胞器及其他细胞成分的功能[编辑]

通过对经超速离心分离得到的细胞器及其他亚细胞成分的研究,可以确定各种细胞器及细胞成分的功能。例如,用离心纯化的线粒体和叶绿体进行实验,得知这些细胞器在能量转换中的重要作用。同样,分离由糙面内质网或光面内质网的断片形成的封闭颗粒,将其作为研究糙、光面内质网功能的模型也取得了很好的效果。从分级分离得到的具有生物功能的细胞抽提物称为非细胞体系(cell free system), 广泛应用于细胞生物学研究。因为只有用这种方法,才能将某个生物过程与细胞中发生的其他复杂的反应分割开来,从而确定其详细的分子机制。应用这种方法所取得的早期成果是阐明了蛋白质合成机制。首先发现,细胞粗提物可以从RNA翻译出蛋白质。把粗提物进行分级分离,即可得到与蛋白质合成有关的核糖体、tRNA及各种酶的成分。各种纯化的组分一旦得到后,就可以分别地采取加入或不加入进行对照,弄清楚每个组分在蛋白质合成过程中的确切作用。在确定了蛋白质合成过程中的各成分的作用之后,体外非细胞体系蛋白翻译系统被成功地用于破译遗传密码,即用已知序列的合成多核苷酸仵为mRNA, 在体外翻译成多肽。

蛋白质的分离与鉴定[编辑]

蛋白质是细胞内的最主要成分,它们不仅参与形成细胞的各种结构,还几乎是细胞所用功能的执行者。因此,分离和鉴定各种目的蛋白,也是当今细胞生物学不可缺少的技术。
将蛋白质进行分级分离并最终进行纯化,常常需要综合运用多种分离手段才能够完成,包括盐析、有机溶剂沉淀、各种常规层析、高压液相层析(high performance liquid chromatography, HPLC)等。要根据目的蛋白质在组织或细胞中的含量,蛋白质分子量的大小,蛋白质的理化性质及检测方法来摸索、选择合适的途径。

用层析的方法纯化蛋白质[编辑]

分离纯化细胞中某种特定的蛋白质最常用的方法是柱层析(column chromatography)。可以将细胞匀浆或经过盐析、有机溶剂沉淀等处理的样品在常压或高压下,通过用固体性颗粒充填形成的柱,不同的蛋白质因与颗粒相互作用的不同而被不同程度地滞留。当它们从柱的底部流出时,可被分别收集。
根据所选择的充填颗粒的不同,常用的柱层析可以分为:①离子交换层析,充填颗粒带有正电或负电,蛋白质按其表面电荷的分布而被分离;②凝胶过滤层析,充填颗粒为多孔性的凝胶颗粒,根据蛋白质的大小将其分离;③疏水性层析,将疏水性基团共价结合在充填颗粒上,不同蛋白质表面疏水区域会有强弱的差异,流出柱的速度也不同;④亲和层析,把能够与蛋白质表面的特定部位进行特异性结合的分子共价连接于惰性多糖类颗粒上,如酶的底物、特异性抗体或抗原,根据蛋白质亲和性的不同将其分离。亲和层析分离纯化重组蛋白为最常用的方法。
值得强调的是,由于蛋白质的结构、理化性质的复杂多样性,除了带有特殊标签的人工表达蛋白质以外,很难找到针对某种特定蛋白质的特异性亲和层析法。因此,大部分蛋白质的分离纯化需要多种方法,包括多种柱层析法的组合,才能够达到目的。普通柱层析法由于充填颗粒的不均匀等因素,使通过柱的液相流量不均,导致分离能力下降。高压液相层析是将直径在3~lOµm之间的微小球型树脂(通常为硅胶树脂)用特殊的装置均匀充填在层析柱中。由于颗粒小充填紧密,必须加高压才能使液相流过。高压液相层析所用层析柱多为不锈钢柱,分离时间短、效率高,可用来分析各种大小分子,但所需仪器精密,造价高。
各种层析方法包括高压液相层析,多可以维持蛋白质不发生变性,保待蛋白原有的功能。但高压液相层析的反向层析柱常常被用来分离小分子蛋白、用酶或化学试剂切断的蛋白质的多肽混合物,根据多肽亲疏水性特点,流动相采用梯度有机溶剂。

用电泳的方法分析、鉴定蛋白质[编辑]

由于氨基酸带有正电荷或负电荷,蛋白质往往带有净正电荷或净负电荷。将含有蛋白质的溶液加上电场,蛋白质分子就会按照它们的净电荷多少、大小及形状的不同在电场中移动,这一技术称为电泳(electrophoresis)。最初,用淀粉等多孔性基质为支持体,分离水溶液中的蛋白质混合液。但后来,丙烯酰胺逐渐成为最常用的支待体。
1、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳依据分子量的不同分离蛋白质 20世纪60年代中期,利用阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(sodium dodecyl sulfate, SDS)进行改良的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS polyacrylamid gel electrophoresis, SDS-PAGE) , 成为常规的蛋白质分析方法。使单体丙烯酰胺交联聚合成聚丙烯酰胺凝胶作为蛋白质在其中移动的支持体,根据需要控制凝胶孔的大小。先将待分离的蛋白质样品置于SDS溶液中,SDS的疏水端与蛋白质的疏水区结合,其带负电荷的亲水端互相排斥,使折叠的蛋白质分子展开成为伸展的多肽链。此外,常常加入2-巯基乙醇(2-mercaptoethanol,2-ME)或二硫苏糖醇(dithiothreitol, DIT)类的还原剂,使蛋白质中所有的S-S结合键断裂。SDS加还原剂的处理使蛋白质分子失去与其他蛋白质或脂质成分的联系而游离地溶解于溶液当中,也使蛋白质自身的亚单位之间的连接分开。由于所有蛋白质都带有大量的负电荷,蛋白质自身原有的电荷可以忽视,电场中所有蛋白质都向正极迁移,其中小分子比大分子通过凝胶网孔要容易得多,因而迁移快。结果复杂的蛋白质混合物完全按分子量大小依次被分离,经蛋白质染色后,可以观察到整齐排列的条带。
2、等电聚焦电泳依据等电点不同分离蛋白质 蛋白质是否带电荷,是带正电荷还是带负电荷,是由溶液的pH决定的。当溶液在某一pH条件下使某一蛋白质不带电荷时,这个pH就是这种蛋白质的等电点(isoelectric point)。所有的蛋白质都有自己特定的等电点,由于不带电荷,在电场中就不会移动。等电聚焦电泳(isoelectric focusing)是在丙烯酰胺凝胶两端形成电场,使含有不同等电点的两性电解质(ampholyte)在电场当中形成pH梯度,样品中所有的蛋白质在电泳时都向自己的等电点处移动,最后聚集、静止于各自的等电点。等电聚焦电泳分离效果很好。
3、双向电泳有更好的分离效果 单一方向的蛋白质电泳,不管是SDS-PAGE还是等电聚焦,都难免有许多蛋白质由于分子量或等电点的相近或相同而导致相互重叠。把等电聚焦与SDS-PAGE结合进行双向电泳能够产生十分好的分离效果。
方法是先在长条状凝胶介质中进行等电聚焦电泳,然后将凝胶条横放于聚合好的平板SDS-丙烯酰胺凝胶上再进行垂直电泳。
普通的实验室自制的凝胶进行双向电泳可以辨认千种以上不同的蛋白质,使用商业化的条状等电点疑胶及平板SOS丙烯酰胺凝胶加上相应的仪器设备,可以使分辨数量及效果大大增加。双向电泳法在蛋白质分析技术不断进步的今天,仍然被广泛应用,特别是在初步筛选、分析正常与异常组织、细胞中蛋白质表达情况方面仍有不可替代的作用。
双向电泳显现的差异蛋白质条带或点(spot), 常常用质谱技术进行进一步鉴定。单向或双向后的SDS-PAGE也可以进一步通过蛋白质印迹(Western blotting)技术检测特定目的蛋白质分子。

核酸的分离纯化与鉴定[编辑]

差速离心沉淀是核酸分离纯化的常用方法[编辑]

DNA和RNA是细胞重要的功能分子。无论DNA还是RNA,它们在细胞中总是与蛋白质结合,以复合物的形式存在于细胞中。进行核酸分离纯化的过程就是使核酸与细胞内的其他组分分离,去除纯化试剂的污染,并保持核酸一级结构的完整性。
细胞中的DNA分子主要存在于细胞核和线粒体中,RNA分子在细胞核和细胞质中广泛存在。细胞核中的染色体DNA是长的线性分子,相对稳定,纯化过程中产生的机械剪切力即可使其断裂。线粒体DNA是环形分子,一般需以线粒体为起始材料,才能获得高纯度的线粒体DNA。RNA分子较不稳定,且RNA酶广泛存在,防止降解是RNA分子纯化过程中的主要注意事项。
核酸的高负电荷磷酸骨架使其比蛋白、脂类、多糖等细胞内其他组分具有更高的亲水性,可通过选择性沉淀和差速离心使核酸与它们分离。在纯化过程中一般加入对应的核酸酶,而选择性地保留DNA或RNA分子。
异硫氰酸胍等离液剂可使膜脂、蛋白变性,释放出细胞内的核酸分子,是核酸抽提液的主要成分。纯化过程中加入氯仿,可去除细胞内的脂类,并使更多的蛋白变性,易于核酸分离纯化。同RNA相比,DNA分子量高,易于集聚。在细胞裂解后进行高速离心,RNA分子能够保留在上层水相中,使RNA与DNA分离。蛋白酶k能够水解细胞内的蛋白和膜蛋白,能使DNA酶和RNA酶失活,也具有裂解细胞的作用,并且蛋白酶k不易失活,在65℃仍能保持活性,常添加在DNA的抽提液中。
通过离心沉淀的方式可获得保留在水相中的核酸分子。钠离子可中和磷酸骨架的负电荷,在酸性条件下可促进DNA的疏水复性,加入乙醇后,低温孵育,可有效沉淀DNA分子。异丙醇可降低水溶液的极性,一般用来沉淀RNA分子。另外,硅胶膜可有效地吸附溶液中的核酸分子,已广泛地应用到了全自动核酸纯化技术中,适应了后基因组时代大样本核酸分析的需求。

凝胶电泳是核酸分离鉴定的主要方法[编辑]

经离心沉淀分离纯化的核酸(DNA和RNA)分子,通过凝胶电泳可直接判定核酸的纯度、完整性及片段大小。核酸电泳常用的支持体为琼脂糖(agarose)与丙烯酰胺(acrylamide)。与蛋白质电泳相比,核酸电泳更简单。因为核酸分子中的每个单核苷酸都带有一个负电荷,在碱性条件下向阳极移动,故可以按照其构成碱基数的多少被有效地分离。
琼脂糖凝胶电泳操作简单,电泳速度快,样品不需事先处理就可直接进行电泳,结果观察方便。但琼脂糖凝胶电泳分辨率相对较低,不适合分离100碱基以下的核酸分子。可根据待测核酸分子的大小调节琼脂糖浓度。丙烯酰胺凝胶电泳分辨率高,一般多用于500碱基以下的DNA分子片段的分离与测序,可以将两条仅相差一个碱基的DNA片段分开。
建立在琼脂糖凝胶电泳基础之上的印记杂交技术,如Southrn印迹杂交(Southern blot)和Northern印迹杂交(Northern blot)技术,是分子细胞生物学研究的常用方法。