生物化學與分子生物學/其他實驗技術/畢氏酵母(Pichia pastoris)感受態細胞製備及轉化

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畢氏酵母氯化鋰轉化法[編輯]

試劑[編輯]

1M LiCl(用去離子蒸餾水配製,濾膜過濾除菌;必要時用消毒去離子水稀釋)

50% PEG3350(Sigma P3640  用去離子蒸餾水配製,濾膜過濾除菌,用較緊的蓋子的瓶子分裝)

2mg/ml salmon sperm DNA / TE(10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA)-20℃保存

註:醋酸鋰對畢氏酵母無效,僅氯化鋰有效;PEG3350可屏蔽高濃度LiCl的毒害作用;

感受態畢氏酵母的製備[編輯]

接種Pachia pastoris到50ml YPD培養基中,30℃搖菌過夜(約24~28h)培養到OD值為0.8~1.0(約108 Cells/ml);

收穫細胞,用25ml無菌水洗滌一次,室溫下1500g離心10min;

重懸細胞於1ml 100mM LiCl溶液中,將懸液轉入1.5ml離心管;

離心機最大速度離心15秒沉澱菌體,重懸菌體於400ul 100mM LiCl溶液中;

按50ul/管分裝,立即進行轉化;

註:不要將感受態酵母菌冰浴;

畢氏酵母的轉化[編輯]

煮沸1ml鮭魚精DNA 5min,迅速冰浴以製備單鏈擔體DNA;

將感受態酵母菌離心,以Tips去除殘餘的LiCl溶液;

對於每一個轉化,按以下順序加入:

50% PEG3350 240ul
1M LiCl 36ul
2mg/ml 單鏈Salmon sperm DNA 25ul
5~10ug/50ul H2O 質體DNA 50ul

   

劇烈旋渦混勻直至沉澱菌體完全分佈均勻(約1min);

30℃水浴孵育30min;

42℃水浴熱休克20~25min;

6000~8000rpm離心收集酵母菌體;

重懸酵母於1ml YPD培養基,30℃搖床孵育;

1~4h後,取25~100ul菌液鋪選擇性培養基平板,於30℃培養2~3天鑑定;

畢氏酵母PEG1000轉化法[編輯]

試劑[編輯]

緩衝液A:1.0M Sorbitol,10mM Bicine,pH8.35(sigma),3%(v/v)ethylene glycol

緩衝液B:40%(w/v)PEG1000(sigma),0.2M Bicine,pH8.35

緩衝液C:0.15M NaCl,10mM Bicine,pH8.35

未污染的新鮮、試劑級DMSO,-70℃保存

註:

  • 緩衝液A、B、C均用濾膜過濾,-20℃保存;
  • 將DNA直接加在凍結的酵母細胞上是本實驗的關鍵之處(即使在冰上解凍的待轉化細胞,其攝取外源DNA的能力也在解凍過程中迅速下降;如進行多樣品的轉化,建議按6樣品/組進行);

待轉化畢氏酵母的製備[編輯]

接種環接種Pachia pastoris於YPD平板,30℃培養2d;

挑取單克隆酵母菌株於10mlYPD培養基中,30℃振盪培養過夜;

取步驟2中小量菌液接種到100mlYPD培養基中振盪培養,待其OD值從0.1升到0.5~0.8;

室溫下3000g離心收集酵母菌體,50ml緩衝液A洗滌一次;

重懸菌體於4ml緩衝液A中,按0.2ml/管分裝於1.5ml的離心管中,每管加入11ulDMSO,混合後迅速於液氮中冷凍,

-70℃保存

畢氏酵母的轉化[編輯]

將約50ug線性化質體DNA溶於20ul TE或水中,直接加於凍結的酵母細胞中;加入擔體DNA(40ug變性超聲線性化鮭魚精DNA)以獲得最大轉化率;

37℃水浴孵育5min,中間混合樣品1~2次;

取出離心管,加入1.5ml緩衝液B,徹底混勻;

30℃水浴孵育1h;

室溫下2000g離心10min,去除上清液,菌體沉澱重懸於1.5ml緩衝液C中;

離心樣品,去除上清液,輕微操作將樣品重懸於0.2ml緩衝液C中;

將所有轉化液鋪於選擇性平板,於30℃孵育3~4天後,鑑定;

畢氏酵母電轉化法[編輯]

E.coli TOP10F』感受態細胞的製備[編輯]

取10ul TOP10F』菌液,接種於200ml LB液體培養基中活化培養,37℃,200 rpm,16~18小時。取100ul菌液接種於200ml液體LB培養基中。

37℃,200 rpm,培養16~18小時。

滅菌500 ml離心管,4℃,4000 rpm,20 min。得菌體沉澱。棄上清,菌體用10%甘油重懸並洗滌。重複洗滌3次。

第三次離心後,棄絕大部分上清,留下約1ml 液體用於重懸菌體。

從製得得感受態細胞中,取200ul於滅菌EP管中,加入連接反應產物5ul,混勻,不要產生氣泡,在冰上放置5min。

將混勻後得200ul菌液移入電擊杯中。

使用電擊穿孔儀進行轉化,設置為電壓 2500 V,時間 5 ms。

電擊後,往電擊杯中加入 800ul SOC培養基,沖洗出菌體,轉移至滅菌1.5 ml EP管中。37℃,150 rpm ,輕搖45~60 min。

取全部均勻塗佈於含 Zeocin 25 ug/ml 的LLB-Zeocin平板上,正放,待塗布液不在流動,37℃ 培養12~16小時。

線性化質體DNA對Pichia pastorisGS115的轉化[編輯]

取新鮮製備的(或-70℃凍存的)感受態細胞置於冰浴中,使其完全解凍;

  1. 將100μl菌體移出至一新的無菌Eppendorf管中,加入5-20μg線性化質體(5~10μl),輕彈混勻,盡數吸出轉移到0.2cm 型的電穿孔轉化杯中;
  2. 轉化杯置於冰浴中5~10分鐘,保持低溫。
  3. 電穿孔轉化電擊條件:電壓:1500V;電阻:400Ω;電容:25μF;脈衝時間:10mS;一次電擊。
  4. 電擊後,馬上在電擊轉化杯中加入1ml 4℃預冷的1M的山梨醇溶液,用微量移液槍吹打均勻,置於冰浴中;
  5. 取30℃烘至表面半乾的MD培養基平板,在超淨工作枱上無菌操作塗布平板,400μl/板

畢赤酵母電轉化方法[編輯]

菌體的準備[編輯]

  1. 挑取酵母單菌落,接種至含有5ml YPD培養基的50ml三角瓶中,30℃、250-300r/min培養過夜;
  2. 取100-500μl的培養物接種至含有500ml新鮮培養基的2L三角搖瓶中,28~30℃、250-300r/min培養過夜,至OD600達到1.3~1.5;
  3. 將細胞培養物於4℃,1500g離心5min,用500ml的冰預冷的無菌水將菌體沉澱重懸;
  4. 按步驟3離心,用250ml的冰預冷的無菌水將菌體沉澱重懸;
  5. 按步驟3離心,用20ml的冰預冷的1mol的山梨醇溶液將菌體沉澱重懸;
  6. 按步驟3離心,用1ml的冰預冷的1mol的山梨醇溶液將菌體沉澱重懸,其終體積約為1.5ml;
  7. 備註:可將其分裝為80μl一份的包裝冷凍起來,但會影響其轉化效率(2周之內)。

電擊轉化[編輯]

  1. 將5~20μg的線性化DNA溶解在5~10μl TE溶液中,與80μl的上述步驟6所得的菌體混勻,轉至0.2cm冰預冷的電轉化杯中;
  2. 將電轉化杯冰浴5min;
  3. 根據電轉化儀提供的資料,參考其他文獻及多次摸索,確定合適的電壓、電流、電容等參數,按優化的參數,進行電擊;
  4. 電擊完畢後,加入1ml冰預冷的山梨醇溶液將菌體混勻,轉至1.5ml的EP管中;
  5. 將菌體懸液塗佈於MD或RDB平板上,每200~600μl塗布一塊平板;
  6. 將平板置於30℃培養,直至單個菌落出現。

推薦:電壓1.5kV;電容25μF;電阻200Ω。電擊時間為4~10msec