細胞生物學/顯微技術

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細胞生物學研究方法 - 顯微技術 - 細胞的分離和培養 - 細胞組分的分離和純化技術 - 細胞化學和細胞內分子示蹤技術 - 細胞功能基因組學研究技術
人眼的生理結構限定了其分辨能力約為lOOµm。典型的動物細胞直徑為10~20µm, 而核糖體、抗休、ATP等細胞內眾多重要的複合體或分子的直徑都在1~100nm的納米尺度範圍內。因此,觀察細胞的生命活動必須藉助顯微鏡。顯微鏡技術經歷了光學顯微鏡技術、電子顯微鏡技術和納米顯微鏡技術的發展階段。降低最小分辨間隔、呈現細胞內的精細結構,甚至實時呈現活細胞內分子間的作用過程是顯微鏡技術發展的直接成果。對細胞生命活動進行探索的需求推動了顯微鏡技術的進步,而顯微鏡技術的進步也極大地推動了整個生命科學研究的發展。

光學顯微鏡技術[編輯]

儘管A.Van Leeuwenhoek在17世紀70年代用他自製的顯微鏡看到了細菌和動物的精子細胞,但直到19世紀初製造出具有更高分辨能力的光學顯微鏡時,才確認所有的動物和植物都是由細胞構成的,即細胞學說(cell doctrine)。可以說光學顯微鏡與細胞生物學同步而生,不斷發展,是細胞生物學必不可少的研究工具。近年來,由於各種新型示蹤分子、光學原理以及計絆機數據處理等技術的應用使得光學顯微技術的作用日益重要。

普通光學顯微鏡的解像度[編輯]

光學顯微鏡(light microscope)主要由聚光鏡、物鏡和目鏡三部分組成。衡量顯微鏡成像能力的主要指標是顯微鏡的解像度(resolution, R)。解像度是指能夠區分相近兩點的最小距離。能夠區分的兩點的距離越小,則顯微鏡的解像度越高。普通光學顯微鏡的橫向解像度(Rx,y)和縱向解像度(Rz)可按以下公式計算:
Rx,y=0.61λ/n·sinθ, Rz=2λ/(n·sinθ)2
n·sinθ為鏡口率,亦稱數值孔徑(numerical aperture, NA); n為聚光鏡和物鏡之間介質的折射率(空氣約為1,油浸鏡的鏡油為1.3~1.5);θ為標本對物鏡鏡口張角的半角(sinθ的最大值為1); λ為照明光源的波長(人眼敏感的波長為555nm,白光一般採用527nm)。
綜合各種影響因素,普通光學顯微鏡理論上的橫向解像度為250nm,縱向解像度為550nm。由於生物樣品性質和顯微鏡製作工藝的限制,光學顯微鏡實際應用中的橫向解像度約為0.5µm, 而縱向解像度約為lµm。線粒體大小約為0.5µm, 是普通光學顯微鏡通常能觀察到的細胞內最小結構。一般將光鏡下所見物體結構稱為顯微結構(microscopic structure)。
普通光學顯微鏡的放大系統般由物鏡和目鏡組成。物鏡靠近被檢物體,進行第一次放大,目鏡靠近眼睛,將物鏡放大後的圖像再放大。物體經過兩次放大後,總放大倍數為兩次放大倍數的乘積。放大倍數越大並不意味着越能夠看清楚更小的物體,光學顯微鏡放大倍率的最高極限為1600倍。
多數細胞總重量的70%是無色透明的水,只有很少的內含物不透光。因此,未經處理的細胞在普通光鏡下幾乎是看不見的。使細胞成為可見的常用方法就是用染料對細胞的不同組分進行染色(staining)。一些紡織用染料被發現可用於生物組織的着色,並對細胞的特殊部位具有選擇性,如蘇木精(hematoxylin)對負電荷分子有親和性,能顯示出細胞內核酸的分佈;酸性染料如伊紅(eosin)可使細胞質染色;蘇丹染料(sudan dye)在脂肪中的溶解度比在乙醇中大,所以蘇丹染料的乙醇飽和溶液能使脂肪着色。儘管已發現了許多特異性染料,但其大部分的作用機制尚不清楚。
生物組織在染色前必須固定(fixation), 固定使得大分子交聯而保持在原有的位置上,不至於在以後的染色等處理過程中移位或丟失而產生人工假象。常用的固定方法是將組織放在固定液中,如甲醛或戊二醛溶液,這兩種分子都能夠與蛋白質的游離胺基酸形成共價鍵,從而將鄰近的蛋白質分子牢固地交聯在一起。
大部分的組織太厚而不能在顯微鏡下直接觀察,固定後還需製成薄切片(section), 然後將切片黏附在載玻片表面進行染色。但由於固定後組織仍很柔軟,在切片前需用支持劑——蠟或樹脂進行包埋(embed)。適用於光鏡觀察的切片厚度為l~lOµm。

相差顯微鏡通常用於觀察活細胞[編輯]

在觀察樣品的製作過程中,細胞成分的丟失或失真通常是難以避免的。若想避開這個問題,只有不加固定、染色等程序,直接觀察活細胞,這需要特殊的光學系統。
光的波長決定可見光的各種色彩,振幅決定光的亮度。波長和振幅的改變能夠被入眼所辨識。光在通過活細胞時,波長和振幅幾乎沒有改變,但由於細胞各結構的密度不同,通過緻密部分(如細胞核)的光線,速度變慢,與通過鄰近部位(如細胞質)的光線之間產生相位偏差或光程差,這種差異人眼不能分辨。相差顯微鏡(phase contrast microscope)利用光的繞射和干涉效應把透過標本不同區域的光波的光程差變成振幅差,使活細胞內各種結構之間呈現清晰可見的明暗對比。
觀察培養細胞的結構常用倒置相差顯微鏡,它的特點是光源和聚光鏡裝在載物台的上方,相差物鏡在載物台的下方,可以清楚地觀察到培養瓶內的貼壁或懸浮細胞。
相差顯微鏡的最大優點是能夠觀察活細胞的活動,但由於許多細胞運動緩慢,難以在短時間內完成觀察,因此需要用顯微電影攝影術(microcinematography)或電視錄像(video recording)以一定時間間隔拍攝記錄。當影片或電視錄像帶以正常速度放映時,所拍攝的情節就被大大地加快了,用這種方法可以準確地記錄細胞或細胞器的運動過程和速度。

暗視野顯微鏡通過散射光成像[編輯]

暗視野顯微鏡(dark-field microscope)是將光源以一定的角度傾斜照射到樣品上,照射光無法進入物鏡,只有從被照樣品發出的散射光能進入物鏡被放大,在黑暗的背景下呈現明亮的像。暗視野顯微鏡主要是觀察物體的輪廓,分辨不清內部的微細構造,適合於觀察活細胞內的細胞核和線粒體、液體介質中的細菌和真菌等。暗視野顯微鏡也可用於觀察細胞的運動。

熒光顯微鏡可以呈現強反差的彩色圖像[編輯]

熒光分子可以在吸收特定波長的光後,發射出更長波長的可見光,前者稱為激發光(excitation light), 後者稱為發射光(emission light)。由於熒光分子可以使被檢樣品呈現不同的染色,因此也稱熒光染料。細胞內某些天然物質如葉綠素就是熒光分子;一些細胞成分雖然不是熒光分子,但可以用熒光分子對其進行染色或標記,這在實際當中有着廣泛的應用。比如,吖啶橙能對細胞DNA與RNA同時染色,顯示不同顏色的熒光。DNA呈綠色,RNA呈紅色。與抗體共價結合的熒光分子,可以用來特異性地檢測細胞表面或固定後的細胞內特定的抗原。
與普通光學顯微鏡相比,熒光顯微鏡(fluorescence microscope)在結構上的突出特點是具有兩組濾光片。第一組濾光片在光源與標本之間,僅能通過熒光染料的激發光;第二組濾光片在標本與物鏡之間,僅能通過激發出的熒光。熒光顯微鏡觀察到的像是以暗背景為映襯的,因此具有成像反差強,檢測靈敏度高的特點。此外,使用熒光顯微鏡觀察細胞內標記了不同熒光染料的分子可以呈現彩色圖像。多種對細胞內特定離子有特異親和性或依賴於細胞內酶的催化作用才能發出熒光的活體熒光染料,使人們可以對活細胞內分子的動態變化進行實時觀察。基於以上特點,熒光顯微技術被廣泛應用於細胞生物學研究。

共聚焦雷射掃描顯微鏡可以提供高清晰的彩色三維圖像[編輯]

用普通光學顯微鏡觀察標本的菏切片,無法得到三維結構的信息,且光學顯微鏡是全視野照明,來自焦平面前後的漫射光線參與最後成像,降低了圖像的反差和解像度。共聚焦是指物鏡和聚光鏡互相共焦點,亦即兩者同時聚焦到一個點,保證了只有從標本焦面發出的光線聚焦成像,焦面以外的漫射光不參加成像,因此能有效抑制背景噪聲,提高信噪比,使圖像更加清晰。此外,由共聚焦產生的縱向解像度的增強,使對細胞內部結構進行「光學切片」成為可能。這是共聚焦顯微鏡與普通光學顯微鏡相比的突出優勢。共聚焦雷射掃描顯微鏡(confocal laser scanning microscope, CLSM)以單色雷射作為光源,對樣品焦平面進行掃描,產生二維圖像,改變焦平面即可得到一系列二維圖像。圖像信息經計算機重建,就可得到完整的三維圖像,並可從空間的任意角度觀察標本的整體結構。
CLSM多用於檢測發射熒光或用熒光標記的物質,其橫向和縱向解像度一般為200nm和500nm, 基本達到了光學顯微鏡解像度的理論值。由於其操作簡便,可觀察活細胞,在細胞生物學的研究中被廣泛應用。CLSM可以辨別細胞內許多複雜物質的三維結構,包括構成細胞骨架系統的纖維、染色體及基因的排列等。

超分辨光學顯微鏡的解像度達到納米尺度[編輯]

光的繞射效應,即穿過小孔徑後的光會發生擴散,使光不能用來觀察比其本身波長短得多的細節。這是光學顯微鏡存在解像度極限的主要原因。1873年德國人Ernst Abbe首先闡明了繞射效應對光學顯微鏡解像度影響,確定了物鏡鏡口率、照明光線波長與顯微鏡解像度的關係。因此,通常將由於光的繞射效應導致的光學顯微鏡解像度極限稱為Abbe限度(Abbe limit)。近幾年來,在應用新的光學原理(如非線性光學原理)、發光/示蹤分子和信號分析技術的基礎上,已經建立起了實用的能夠突破Abbe限度的超分辨顯微技術(super-resolution microsopy), 使光學顯微鏡的解像度達到了30~50nm的納米尺度。
超分辨顯微技術主要是根據熒光分子的發光特性和物理機制,使距離繞射限度內的兩個鄰近熒光分子差異激發,以呈現解像度超越Abbe限度的圖像。也就是說,超分辨顯微技術利用熒光基團的物理或化學特性,使相鄰的繞射限度內的分子處於不同的的狀態,以使彼此區分開來。一般可將超解像度顯微技術可以分為兩類:一類是集成成像技術,利用結構化光照明在空間上調製位於繞射限度內分子的熒光行為,使全部熒光分子不同時發射,以此來獲得解像度小於繞射限度的圖像,如受激發射損耗(stimulated emission depletion, STED)技術、相關的可逆飽和線性熒光躍遷(reversible saturable optical linear fluorescence trans山ons, RESOLIT)技術,以及飽和結構光照明顯微技術(saturated structured illumination microscopy, SSIM); 另一類是單分子成像技術,利用光開關(photo switching)或其他機制在不同的時點隨機激活位於繞射限度內的單個分子,然後測量每一個單獨熒光基團的位置,並進行三維重建,以此獲得繞射限度內的圖像,如隨機光學重建顯微技術(stochastic optical reconstruction microscopy, STORM)、光激活定位顯微技術(photoactivated localization microscopy, PALM)和熒光光激活定位顯微技術(fluorescence photoactivation localization microscopy, FPALM)。
超分辨顯微技術利用可見光(380~740nm), 具有非接觸、無損傷、可觀測內部結構的特點。這些特點使其可以觀測活的組織或細胞,並可進行內部深層三維結構成像。同本節後面介紹的能夠達到納米尺度的顯微技術,即電子顯微鏡技術、掃描隧道電子顯微鏡技術和原子力顯微鏡技術相比,超分辨顯微技術在細胞生物學研究中具有較明顯的優勢,隨着其技術和設備的發展和完善,必將像普通光學顯微鏡一樣,在生命科學研究中具有廣泛應用。

電子顯微技術[編輯]

光學顯微鏡的解像度受照明光源波長的限制,無法分辨小於0.2µm的微細結構。電子的波長比光要短得多,電子顯微鏡(electron microscope, EM)用電子束做光源大大提高了顯微鏡的解像度。電子運動越快,波長就越短,以10萬伏特電壓加速的電子,其波長約為0.004nm。 理論上,用這樣短波電子照明,顯微鏡的解像度可達到0.002nm, 但由於電磁透鏡的相差比玻璃透鏡的相差要大得多,電鏡的實際解像度不超過0.1nm。這樣的解像度用於檢查金屬材料時,可以清晰看到相鄰的金原子間的距離(0.2nm)。生物樣品由於標本的製備,反差及照射損傷等原因,電子顯微鏡的解像度實際上僅約2nm, 儘管如此,它仍是光學顯微鏡解像度的100倍,可以觀察到細胞膜、細胞核、線粒體、高爾基複合體、核糖體、中心粒等細胞器的微細結構。這種在電子顯微鏡下觀察到的細胞的結構稱為亞顯微結構(submicroscopic structure)或超微結構(ultrastructure)。

透射電子顯微鏡用於觀察細胞的超微結構[編輯]

電子顯微鏡通常是指透射電子顯微鏡(transmission electron microscope, TEM), 它的總體設計與光學顯微鏡相似,但要大得多,且上下顛倒。照明光源是釋放電子的鎢絲,作為陰極位於約2m高的鏡筒頂端。電子能與空氣中的分子碰撞而發生散射,故需將鏡筒中的空氣抽出保持高度真空狀態。由燈絲髮射的電子受到其下方陽極吸引而加速,通過一個中央小孔而形成電子束,沿鏡筒向下運動。沿鏡筒設置的精密線圈產生軸對稱磁場從而作為電磁透鏡使電子聚焦,就如同光學顯微鏡中光線被玻璃透鏡聚焦那樣。標本通過一個氣閘送入鏡筒,置於電子束的通道上。電子束通過標本時,根據標本各部位密度的不同,部分電子發生散射,只有剩餘的電子成像,經物鏡和投影鏡等放大後投射到照相底片上或熒光屏上。散射的電子不參加成像,故標本中密度大的部分成像後形成電子流蜇減少的暗區,相反,標本密度小的部位散無線電子少而形成明區。
用於電鏡觀察的生物標本需特殊製備。電鏡標本必須置於高真空中進行觀察,所以含水的活組織細胞是無法觀察的。為防止生物樣品在死亡後和在脫水過程中產生結構改變,離體的生物標本要迅速加以固定。常用戊二醛和四氧化鋨雙重固定,戊二醛在蛋白質分子之間形成共價鍵將它們交聯固定,四氧化俄除了與蛋白質共價結合之外,還對多種成分特別是對脂類有良好的固定效果。
電子的穿透力很弱,鏡檢前必須將固定後的組織製成50~100nm, 即約細胞的1/200厚度的超簿切片。為此,要將固定和脫水的標本放入液態的單體樹脂中浸透,加溫使之聚合成為固體的包埋塊。在特定的超薄切片機上,用玻璃刀、鑽石刀將包埋塊切成超薄切片,最後將切片置於直徑3mm的金屬載網上進行觀察。
電鏡下所見到的標本的反差,取決於組成元素的原子序數,原子序數越高,散射的電子越多,反差越大。生物分子主要是由一些低原子序數的輕元素(氫、氧、碳、氮等)組成的,它們散無線電子的能力非常弱,在電鏡下難以見到明暗反差。為此,常常在切片前後用一些鋨、鈾、鉛等重金屬的鹽類浸染標本進行電子染色,以增大反差。細胞的不同成分對這些鹽類有不同的親和力,造成染色程度的不同,顯示不同的反差。例如,鋨對脂質容易着色,用來觀察細胞的各種膜性構造效果非常好。
高壓透射電鏡(high-voltage electron microscope, HVEM)的光源的加速電壓一般在20萬伏特以上。加速電壓在50萬伏特以上則稱為超高壓電子顯微鏡。目前世界上已有加速電壓在300萬伏特的超高壓電鏡。超高壓電鏡由於增加了加速電壓,增強了電子的穿透能力,可以觀察更厚的電鏡切片。在10萬伏特下,可見到3~7µm厚切片中的細胞超微結構,加速電壓為300萬伏特時,可以觀察到10µm厚切片內的超微結構。而且加速電壓越高,電子波長越短,電鏡的解像度也越高。
透射電子顯微鏡藉助金屬投影、冰凍斷裂及冰凍蝕刻技術可獲取三維圖像。
金屬投影法(metal shadowing)把帶有乾燥樣品的載網放在真空罩中,高溫蒸發鉑或鈀等重金屬,使金屬顆粒以一定的傾斜角度噴向樣品。這樣,隨着樣品表面的高低起伏,重金屬形成不同厚度的薄膜,顯示了投影(shadowing)效果,給出了一個樣品表面結構的三維圖像。如果噴鍍的樣品很小或噴鍍後的金屬膜薄得足以使電子束透過,則可以直接用透射電鏡進行觀察,比如一些蛋白、核酸類大分子,病毒顆粒及細胞壁這樣的樣品。對厚樣品則需在噴鍍後將樣品部分溶去,僅剩薄薄的樣品的金屬復型(replica), 再用碳元素垂直噴鍍形成一碳膜,加固復型,然後在透射電鏡下觀察復型。下述冰凍斷裂與冰凍蝕刻兩種技術是金屬復型法的最好應用事例,為細胞生物學的研究作出了重大貢獻。
冰凍斷裂(freeze-fracture)多用於觀察細胞膜性結構的內部構造。將樣品用液態氮(-196℃)快速冷凍後,用刀切割凍結的樣品組織塊。切面常常從膜脂質雙層的中央疏水部通過,暴露出膜的內部構造。將暴露出的切面用鉑進行噴鍍,製成復型後觀察。用此技術對蛋白質在膜內的分佈悄況進行觀察,方便、直觀,具有劃時代意義。
冰凍蝕刻(freeze-etching)與冰凍割斷法一樣,低溫(液態氦,-269℃)下切割後,徐徐升溫,真空下使水分升華(冷凍乾燥),在細胞周圍的冰迅速減少下陷的同時,細胞內的游離水也減少下陷,膜和其他一些結構暴露出來,製作復型後有顯著的斷面浮雕效果,用於觀察細胞的內部構造。

掃描電子顯微鏡用於觀察生物樣品表面的立體結構[編輯]

用透射電鏡觀察超薄切片僅能反映細胞的二維結構,雖然可以通過觀察大量的連續切片重建立體圖像,但費時費力,步驟繁瑣。用掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope, SEM)可以直接觀察標本表面的三維形態。掃描電鏡比透射電鏡小,結構簡單。透射電鏡是電子透過標本後成像,掃描電鏡是電子束照射在標本後產生二次電子成像。樣品需經固定、乾燥並用重金屬膜覆蓋。由光源發出的非常細的電子束(一次電子)在樣品表面逐點逐線地掃描,產生的散射,即二次電子信號被收集、轉換放大,在電視熒光屏上同步掃描成像。樣品產生二次電子多的部位在熒光屏上相應的點就亮,反之則暗。由於二次電子產生的多少與電子束在標本表面的投射角有關,亦即與樣品的表面起伏有關,在熒光屏上就會得到樣品表面形貌的立體圖像。
掃描電鏡解像度較低(3~10nm), 不及透射電鏡,多用於細胞整體或組織的觀察。

冷凍電鏡用於解析生物大分子的結構[編輯]

在低溫下使用透射電子顯微鏡觀察樣品的顯微技術,被稱為冷凍電子顯微鏡技術,簡稱冷凍電鏡(cryo-electron microscopy, cryo-EM)。冷凍電鏡是重要的結構生物學研究方法,它與另外兩種技術:X射線晶體學(X-ray crystallography)和核磁共振(nuclear magnetic resonance, NMR)一起構成了高解像度結構生物學研究的基礎,在獲得生物大分子的結構並揭示其功能方面極為重要。經過三十多年的發展,冷凍電鏡技術已經產生了多種解析生物分子或細胞結構的方法。2017年諾貝爾化學獎授予三位冷凍電鏡領域的學者,表彰他們「在開發用於溶液中生物分子高解像度結構測定的冷凍電子顯微鏡技術方面的貢獻」。
目前備受矚目的冷凍電鏡結構解析則主要是指單顆粒三維重構技術。該方法通過對大量離散分佈的單個分子的電子顯微像進行統計分析來解析生物大分子的三維結構。
快速冷凍可以使蛋白質和所在的水溶液環境迅速從溶液態轉變為玻璃態,玻璃態能使蛋白質結構保持其天然結構狀態 如果以緩慢溫和的方式冷凍,這個過程會形成晶體冰,生物分子的結構將被晶格力徹底損壞。低劑量冷凍成像能夠保存樣品的高解像度結構信息,確保了從電鏡圖形中解析蛋白質結構的可能性。與此同時,在電鏡圖像處理算法方面奠定和發展了這項技術的理論基礎。 冷凍電鏡技術大致可以分為三個主要步驟:①樣品冷凍(保持蛋白溶液態結構);②冷凍成像(獲取二維投影圖像);③三維重構(從二維圖像通過計算得到三維密度圖)。
冷凍電鏡技術的特點是:不需要大量樣品,不需要結晶,即可迅速解析大型蛋白複合體原子解像度三維結構。

其他顯微技術[編輯]

從1665年R.Hooke第一次使用顯微鏡觀察細胞以來,顯微鏡的發展經歷了光學顯微鏡時代和電子顯微鏡時代,目前掃描探針顯微鏡(scanning probe microscope, SPM)也得到了很好的開發和應用。掃描探針顯微鏡實現了人們直接觀察單個原子的夢想,而且還能對原子進行操控、組合,形成具有新的物理、化學、生物學特性的顆粒。掃描隧道顯微鏡和原子力顯微鏡是掃描探針顯微鏡體系的主體,由於它們的解像度和可操控的顆粒在納米水平,因此也稱作納米顯微技術。

掃描隧道顯微鏡可直接觀察到大分子的三維結構[編輯]

掃描隧道顯微鏡(scanning tunneling microscope, STM)是利用量子力學的隧道貫穿理論設計製造的,它使用一個直徑為原子尺度的精密的探針在觀察標本的表面進行掃描,探針尖不接觸所研究樣品的表面,與樣品之間保持大約1nm的微小的間隙,在針尖和樣品間施加一定電壓,就會產生所謂的隧道效應,即在兩者之間出現以一個根據觀測表面形貌變化的隧道電流。當探針在平行於樣品表面的恆定高度移動並掃描時(恆高方式),同步記錄隧道電流的變化,就可以獲得所觀察物體表面的原子水平的微觀信息。也可以通過反饋系統的調節,使探針尖隨樣品表面的變化上下移動掃描並保持恆定的隧道電流,此時記錄針尖和樣品表面的距離變化就可以得到表面的形貌特徵(恆流方式)。
掃描隧道電鏡的主要優點是有非常高的解像度(側解像度為0.1~0.2nm, 縱解像度0.001nm), 而且可以在大氣和液體等非真空狀態下工作,避免了其他電鏡採用的高能電子束對樣品的輻射和熱損傷作用,因此在細胞生物學、分子生物學和日益發展的納米生物學的研究中得到非常廣泛地應用。迄今已經直接用掃描隧道顯微鏡觀察到自然狀態下DNA分子雙螺旋結構中的大溝和小溝以及大腸桿菌的環狀DNA的結構。

原子力顯微鏡可對單個分子進行操控[編輯]

原子力顯微鏡(atomic force microscope, AFM)是在掃描隧道顯微鏡基礎之上發展起來的新型掃描探針顯微鏡,與掃描隧道顯微鏡相比,原子力顯微鏡的一個突出的優點是不需要所檢測的樣品具有導電性,它通過分析探針尖與樣品之間的原子間作用力來獲取所觀察表面的微觀信息,這對研究通常不 導電的生物材料是一項非常有意義的革新。
原子力顯微鏡的探針被置於一個彈性系數很小的微懸臂的一端,微懸臂的另一端固定。探針尖和被檢測的樣品表面輕輕的接觸,針尖的原子和樣品表面的原子之間的微弱的排斥力使對力的變化非常敏感的微懸臂的游離端發生彎曲,經過光學透鏡準直和聚焦後投射在微懸臂背面的一束雷射及其監測器能將這種微弱的曲度的變化轉換為電流的變化。通過移動樣品平台使探針在被檢測材料的表面逐點作快速掃描時,樣品表面的微細結構特徵的三維坐標數據就被轉換為圖像信息並準確地呈現在屏幕上。
原子力顯微鏡的工作範圍與掃描隧道顯微鏡相似,可以在三態(固態、氣態和液態)狀況下工作,但其解像度不及後者,目前主要用於活細胞表面及生物大分子空間伸展及其結晶體表面的觀測,例如肌動蛋白聚合動力學中自組織纖維的多態性分析。原子力顯微鏡可以對單個分子進行操作,通過檢測操作後引發的生物化學反應來研究生物大分子和大分子複合物的功能,即進行所謂的分子手術 (molecular surgery)。
以掃描隧道顯微鏡和原子力顯微鏡為代表的納米顯微技術實現了人們直接觀察和操控原子的夢想,也使納米技術進入到生命科學的研究中。納米技術與生命科學相結合,產生了21世紀最典型的交叉學科——納米生物學。納米生物學的發展使人們對生物大分子複合物和細胞生理活動的認識進入到前所未有的領域。