生物化学与分子生物学/基因治疗

基因诊断和基因治疗 - 基因诊断 - 基因治疗
基因治疗是以改变人遗传物质为基础的生物医学治疗，即通过一定方式将人正常基因或有治疗作用的DNA片段导入人体靶细胞以矫正或置换致病基因的治疗方法。它针对的是疾病的根源，即异常的基因本身。在此过程中，目的基因被导入靶细胞内，它们或与宿主细胞染色体整合成为宿主细胞遗传物质的一部分，或不与宿主细胞的染色体整合而独立于染色体以外，但都可以在宿主细胞内表达基因产物蛋白质，而达到治疗作用。目前基因治疗的概念也有了较大扩展，凡是采用分子生物学技术和原理，在核酸水平上展开的对疾病的治疗都可纳入基因治疗范围。基因治疗的范围也从过去的单基因遗传病扩展到恶性肿瘤、心脑血管疾病、神经系统疾病、代谢性疾病等。根据治疗的靶细胞不同，基因治疗可分为生殖细胞(germ -line)治疗和体细胞(somatic cell)治疗两大类，由于生殖细胞基因治疗涉及伦理及遗传等诸多问题，目前人类基因治疗研究与应用的重点是体细胞治疗。

基因治疗的基本策略主要围绕致病基因

基因治疗是指将目的基因导入靶细胞，使之成为宿主细胞遗传物质的一部分，目的基因的表达产物对疾病起到治疗的作用。绝大部分疾病的发生都受到遗传因素的影响，如果用正常的健康基因替代有缺陷的基因来治疗疾病，则为这些疾病的病人提供了一个全新的治疗模式。随着基因治疗研究的不断深入，不仅可以将外源性正常基因导入病变细胞，产生正常的基因表达产物来补充缺失或功能异常的蛋白质；还可以采用适当的技术抑制过表达基因；亦可以将特定基因导入非病变细胞，在体内表达特定产物；或者向肿瘤细胞等功能异常的细胞中导入该细胞本来不存在的基因，利用这些基因的表达产物来治疗疾病。根据不同疾病的发病机制，所采用的基因治疗方式也有所不同，基因治疗的基本策略主要有以下几种：

缺陷基因精确的原位修复是基因治疗的理想方法

包括对致病基因的突变碱基进行纠正的基因矫正(gene correction)和用正常基因通过重组原位替换致病基因的基因置换(gene replacement)。这两种方法均属于对缺陷基因精确的原位修复，既不破坏整个基因组的结构，又可达到治疗疾病的目的，是最为理想的治疗方法，但目前尚未能从理论和技术上得到突破。

基因增补是目前临床上使用的主要基因治疗策略

不删除突变的致病基因，而在基因组的某一位点额外插入正常基因，在体内表达出功能正常的蛋白质，达到治疗疾病的目的。这种对基因进行异位替代的方法称为基因添加(gene augmentation)或称基因增补，是目前临床上使用的主要基因治疗策略。基因增补不仅可以用于替代突变基因，也可以在原有基因表达水平不足以满足机体需要的情况下，异位过表达来增强体内某些功能。例如在血友病病入体内导入凝血因子Ⅸ基因，恢复其疑血功能；将编码干扰素和白介素-2等分子的基因导入恶性肿瘤病人体内，可以激活体内免疫细胞的活力，作为抗肿瘤治疗中的辅助治疗，也称为基因免疫治疗。
由于目前尚无法做到基因在基因组中的准确定位插入，因此增补基因的整合位置是随机的。这种整合可能会导致基因组正常调节结构的改变，甚至可能导致新的疾病。2004年，法国一儿童医院接受基因治疗的17名严重联合免疫缺陷症病入中，有3人因逆转录病毒载体插入并激活LMO-2 基因而罹患白血病。

基因治疗可采用基因沉默或失活

有些疾病是由于某一或某些基因的过度表达引起的，向病人体内导入有抑制基因表达作用的核酸，如反义RNA、核酶、干扰小RNA等，可降解相应的mRNA或抑制其翻译，阻断致病基因的异常表达，从而达到治疗疾病的目的。这一策略称为基因失活(gene inactivation) 或基因沉默(gene silencing), 也称为基因干预(gene interference)。需要抑制的靶基因往往是过度表达的癌基因或者是病毒复制周期中的关键基因。

自杀基因亦可应用于基因治疗

上述三种基因治疗的策略都是以恢复细胞正常功能或干预细胞的功能为目的。在肿瘤的治疗中，通过导入基因诱发细胞“自杀”死亡也是一种重要的策略。自杀基因治疗肿瘤的原理是将编码某些特殊酶类的基因导入肿瘤细胞，其编码的酶能够使无毒或低毒的药物前体转化为细胞毒性代谢物，诱导细胞产生“自杀”效应，从而达到清除肿瘤细胞的目的。自杀基因的另一个策略是利用肿瘤细胞特异性启动子序列（如肝癌的甲胎蛋白启动子序列）以激活抑癌基因、毒蛋白基因等 “细胞毒性基因”，通过这些特殊的外源基因在肿瘤细胞中的特异性表达以达到对肿瘤细胞的杀伤作用。

基因治疗的基本程序

基因治疗的基本过程可分为5个步骤：①选择治疗基因；②选择携带治疗基因的载体；③选择基因治疗的靶细胞；④在细胞和整体水平导入治疗基因；⑤治疗基因表达的检测。

选择治疗基因是基因治疗的关键

细胞内的基因在理论上均可作为基因治疗的选择目标。许多分泌性蛋白质如生长因子、多肽类激素、细胞因子、可溶性受体（人工构建的去除膜结合特征的受体），以及非分泌性蛋白质如受体、酶、转录因子的正常基因都可作为治疗基因。简言之，只要清楚引起某种疾病的突变基因是什么，就可用其对应的正常基因或经改造的基因作为治疗基因。

治疗基因的载体可携带基因进入靶细胞

大分子DNA不能主动进入细胞，即使进入也将被细胞内的核酸酶水解。因此选定治疗基因后，需要适当的基因工程载体将治疗基因导入细胞内并表达。目前所使用的基因治疗用载体有病毒载体和非病毒载体两大类，基因治疗的临床实施一般多选用病毒载体。
野生型病毒必须经过改造，以确保其在人体内的安全后才能作为基因治疗的载体。野生型病毒基因组的编码区主要为衣壳蛋白、酶和调控蛋白编码，而非编码区中则含有病毒进行复制和包装等功能所必需的顺式作用元件。基因治疗所用病毒载体的改造是剔除其复制必需的基因和致病基因，消除其感染和致病能力。原有的病毒复制和包装等功能改由包装细胞(packaging cell)提供。包装细胞是经过特殊改造的细胞，已经转染和整合了病毒复制和包装所需要的辅助病毒基因组，可以完成病毒的复制和包装。在实际应用中，治疗用病毒载体需要先导入体外培养的包装细胞，在其中进行复制并包装成新的病毒颗粒，获得足撮的重组病毒后再用于基因治疗。
目前用作基因转移载体的病毒有逆转录病毒(retrovirus)、腺病毒（adenovirus）、腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)、单纯疱疹病毒(herpes simplex virus, HSV)等。不同类型的病毒载体在应用中具有不同的优势和缺点，可依据基因转移和表达的不同要求加以选择。以下仅以最为常用的逆转录病毒和腺病毒载体为例予以说明。
1、逆转录病毒载体 逆转录病毒属于RNA病毒，其基因组中有编码逆转录酶和整合酶(integrase)的基因。在感染细胞内，病毒基因组RNA被逆转录成双链DNA,然后随机整合在宿主细胞的染色体DNA上，因此可长期存在于宿主细胞基因组中，这是逆转录病毒作为载体区别于其他病毒载体的最主要优势。将逆转录病毒复制所需要的基因除去，代之以治疗基因，即可构建成重组的逆转录病毒载体。在目前的基因治疗中，70%以上应用的是逆转录病毒载体。
逆转录病毒载体有基因转移效率高、细胞宿主范围较广泛、DNA整合效率高等优点。缺点主要是在两个方面存在安全性问题，一是病人体内万一有逆转录病毒感染，又在体内注射了大剂量假病毒后，就会重组产生有感染性病毒的可能；二是增加了肿瘤发生机会。后者的原因是由于逆转录病毒在靶细胞基因组上的随机整合所致，这种整合可能激活原癌基因或者破坏抑癌基因的正常表达。
2、腺病毒载体 腺病毒是一种没有包膜的大分子双链DNA病毒，可引起人上呼吸道和眼部上皮细胞的感染。人的腺病毒共包含50多个血清型，其中C亚类的2型和5型腺病毒(Ad2和Ad5)在人体内为非致病病毒，适合作为基因治疗用载体。
腺病毒载体不会整合到染色体基因组，因此不会引起病人染色体结构的破坏，安全性高；而且对DNA包被量大、基因转染效率高，此外对静止或慢分裂细胞都具有感染作用，故可用细胞范围广。腺病毒载体的缺点是基因组较大，载体构建过程较复杂；由于治疗基因不整合到染色体基因组，故易随着细胞分裂或死亡而丢失，不能长期表达。此外，该病毒的免疫原性较强，注射到机体后很快会被机体的免疫系统排斥。

选择基因治疗的靶细胞通常是体细胞

基因治疗所采用的靶细胞通常是体细胞(somatic cell), 包括病变组织细胞或正常的免疫功能细胞。由于人类生殖生物学极其复杂，主要机制尚未阐明，因此基因治疗的原则是仅限于患病的个体，一代，为此国际上严格限制用人生殖细胞(germ line cell) 进行基因治疗实验。适合作为而不能涉及下靶细胞应具有如下特点：①靶细胞要易于从人体内获取，生命周期较长，以延长基因治疗的效应；②应易于在体外培养及易受外源性遗传物质转化；③离体细胞经转染和培养后回植体内易成活；④选择的靶细胞最好具有组织特异性，或治疗基因在某种组织细胞中表达后能够以分泌小泡等形式进入靶细胞。
人类的体细胞有 200 多种，目前还不能对大多数体细胞进行体外培养，因此能用于基因治疗的体细胞十分有限。目前能成功用于基因治疗的靶细胞主要有造血干细胞、淋巴细胞、成纤维细胞、肌细胞和肿瘤细胞等。

造血干细胞 造血干细胞 (hematopoietic stem cell, HSC)是骨髓中具有高度自我更新能力的细胞，能进一步分化为其他血细胞，并能保待基因组DNA的稳定。HSC已成为基因治疗最有前途的靶细胞之一。由于造血干细胞在骨髓中含量很低，难以获得足够的数量用于基因治疗。人脐带血细胞是造血干细胞的丰富来源，其在体外增殖能力强，移植后抗宿主反应发生率低，是替代骨髓造血干细胞的理想靶细胞。目前已有跻带血基因治疗的成功病例。
淋巴细胞 淋巴细胞参与机体的免疫反应，有较长的寿命及容易从血液中分离和回输，且对目前常用的基因转移方法都有一定的敏感性，适合作为基因治疗的靶细胞。目前，已将一些细胞因子、功能蛋白的编码基因导入外周血淋巴细胞并获得稳定高效的表达，应用于黑色素瘤、免疫缺陷性疾病、血液系统单基因遗传病的基因治疗。
皮肤成纤维细胞 皮肤成纤维细胞具有易采集、可在体外扩增培养、易于移植等优点，是基因治疗有发展前途的靶细胞。逆转录病毒载体能高效感染原代培养的成纤维细胞，将它再移植回受体动物时，治疗基因可以稳定表达一段时间，并通过血液循环将表达的蛋白质送到其他组织。
肌细胞 肌细胞有特殊的T管系统与细胞外直接相通，利于注射的质粒DNA经内吞作用进入。而且肌细胞内的溶酶体和DNA酶含量很低，环状质粒在胞质中存在而不整合入基因组DNA, 能在肌细胞内较长时间保留，因此骨骼肌细胞是基因治疗的很好靶细胞。将裸露的质粒DNA注射入肌组织，重组在质粒上的基因可表达几个月甚至1年之久。
肿瘤细胞 肿瘤细胞是肿瘤基因治疗中极为重要的靶细胞。由于肿瘤细胞分裂旺盛，对大多数的基因转移方法都比较敏感，可进行高效的外源性基因转移。因此，无论采用哪一种基因治疗方案，肿瘤细胞都是首选的靶细胞。

此外，也可研究采用骨髓基质细胞、角质细胞、胶质细胞、心肌细胞及脾细胞作为靶细胞，但由于受到取材及导入外源基因困难等因素影响，还仅限于实验研究。

将治疗基因导入人体有生物学和非生物学法

目前临床基因治疗实施方案中，体内基因递送(gene delivery)的方式有两种。一种是间接体内疗法(ex vivo) , 即先将需要接受基因的靶细胞从体内取出，在体外培养，将携带有治疗基因的载体导入细胞内，筛选出接受了治疗基因的细胞，繁殖扩大后再回输体内，使治疗基因在体内表达相应产物。其基本过程类似于自体组织细胞移植。另一种是直接体内疗法(in vivo) , 即将外源基因直接注入体内有关的组织器官，使其进入相应的细胞并进行表达。
基因导入细胞的方法有生物学和非生物学法两类。生物学方法指的是病毒载体所介导的基因导入，是通过病毒感染细胞实现的，其特点是基因转移效率高，但安全问题需要重视。非生物学法是用物理或化学法，将治疗基因表达载体导入细胞内或直接导入人体内，操作简单、安全，但是转移效率低。

治疗基因表达的检测方法较多

无论以何种方法导入基因，都需要检测这些基因是否能被正确表达。被导入基因的表达状态可以用PCR、RNA印迹、蛋白印迹及ELISA等方法去检测。对于导入基因是否整合到基因组以及整合的部位，可以用核酸杂交技术进行分析。

基因治疗的医学应用

基因治疗作为一门新兴学科，在很短的时间内就从实验室过渡到临床，已被批准的基因治疗方案有两百种以上，包括肿瘤、艾滋病、遗传病和其他疾病等。在中国，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、血友病Ⅸ因子、抑癌基因TP53 等基因治疗的临床方案已进入市场或临床试验。
遗传病的基本特征是由遗传基因改变所引起的。只受一对等位基因影响而发生的疾病属于单基因遗传病，设计基因治疗方案相对容易，例如镰状细胞贫血、α-地中海贫血、血友病等。高血压、动脉粥样硬化、糖尿病的发生是多个基因相互作用的结果，并受环境因素影响，基因治疗的效果还有待于基础研究的突破。

单基因遗传病的基因治疗 单基因缺陷引起的遗传病，由于其致病基因比较清楚，所以基因治疗方案也相对容易确定。基本方案是通过一定的方法把正常的基因导入到病人体内，表达出正常的功能蛋白。例如将人Ⅸ因子基因与逆转录病毒载体重组后转移到血友病病人自体的皮肤成纤维细胞中，使病入血中Ⅸ因子浓度升高，出血症状及出血次数都明显减少。
针对多基因病的基因治疗 基因治疗最早是针对一些单基因遗传病进行的，但是随着人类对其他疾病分子机制的深入了解、对许多疾病相关基因的分离和功能的研究，人们逐渐将基因治疗的策略用于如恶性肿瘤、心血管疾病、糖尿病及艾滋病等，尤其是对恶性肿瘤的基因治疗寄予极大的希望。目前已被克隆的恶性肿瘤相关基因很多，动物模型比较成熟，病人及亲属易接受，所以，恶性肿瘤的基因治疗研究日趋活跃，并取得了显著的成果。到目前为止世界各国已经批准开展进行的基因治疗方案中，70%以上是针对恶性肿瘤的。

恶性肿瘤的基因治疗包括：针对癌基因表达的各种基因沉默、针对抑癌基因的基因增补、针对肿瘤免疫反应的细胞因子基因导入和针对肿瘤血管生成的基因失活等。
其他的基因治疗方案包括：利用过表达VEGF基因促进血管生成治疗冠心病、针对病毒复制基因的基因沉默治疗艾滋病等。

基因治疗的前景与问题

经过20多年的努力，科学家们在基因治疗领域取得了很大的进步，获得了一些成功，但是仍然存在一些亟待解决的间题。这些问题包括：①缺乏高效、靶向性的基因转移系统；②对于多种疾病的相关基因认识有限，因而缺乏切实有效的治疗靶基因；③对真核生物基因表达调控机制理解有限，因此对治疗基因的表达还无法做到精确调控，也无法保证其安全性；④缺乏准确的疗效评价。目前的基因治疗临床试验中，限于伦理问题，多选择常规治疗失败或晚期肿瘤病入，尚难以客观地评价治疗效果。
将基因治疗方案用于人体必须经过严格的审批程序，需要专门机构的审批与监督。在中国，任何基因治疗方案都要经国家食品药品监督管理局审批。1999年6月颁布的《人基因治疗申报临床试验指导原则》详细规定了基因治疗所用生物制剂的研制、生产工艺、制剂的质量控制、临床实验和临床疗效评价的各个环节中应该遵守的原则。所有基因治疗的临床使用必须严格遵守这些法律法规。
近年来中国对基因诊断与基因治疗领域非常重视，虽然没有新出台专门的规范性文件法规，但在国家大的规划方面均有涉及。在《“十三五”卫生与健康规划》（国发(2016]77号）中提出在加强行业规范的基础上，推动基因检测、细胞治疗等新技术的发展。在《“十三五”国家战略性新兴产业发展规划》（国发(2016)67号）中提出发展专业化诊疗机构，培育符合规范的液体活检、基因诊断等新型技术诊疗服务机构。推动基因检测和诊断等新兴技术在各领域应用转化。建立具有自主知识产权的基因编辑技术体系，开发针对重大遗传性疾病、感染性疾病、恶性肿瘤等的基因治疗新技术。在《“十三五”国家科技创新规划》（国发[2016]43号）中提出开展重大疫苗、抗体研制、免疫治疗、基因治疗、细胞治疗、干细胞与再生医学、人体微生物组解析及调控等关键技术研究，研发一批创新医药生物制品，构建具有国际竞争力的医药生物技术产业体系。在《中国防治慢性病中长期规划(2017—2025年》（国办发[2017]12号）提出支持基因检测等新技术、新产品在慢性病防治领域推广应用。