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生物化学与分子生物学/DNA实验技术/质粒DNA的提取

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原理

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采用碱变性发抽提取质粒DNA。该法是基于染色体DNA与质粒DNA的变性预复性的差异而达到分离目的的。在PH大于12的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开变性。质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状结构的两条互补链不会完全分离，当以pH5.2的乙酸钠高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复到原来的构型，保存在溶液中。而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

方法

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  1. 挑取一环在LB固体培养基平板上生长的含PUC57质粒的大肠杆菌，接在含有100μg/ml氨苄青霉素（Amp）的LB液体培养基（5ml/15ml试管）中，37℃震摇培养过夜。
  2. 将1.5ml菌液加入微离心管中，14000r/min，离心10秒，其取上清液。反复数次，收集全部菌体。
  3. 倾去上清，滤纸吸干。
  4. 加30μlTE缓冲液（10mmol/L   Tris—HCl,1mmol/L   EDTA,pH8.0）,振荡起菌体。
  5. 加30μlTENS溶液（10mmol/L   Tris—HCl, pH8.0，1mmol/L   EDTA,0.1mol/L  NaOH,0.5%SDS）,震荡10秒至溶液变粘稠。
  6. 加150μl 3.0mol/LnaAC,震荡3—5S，14000r/min，离心3分钟，沉淀细胞碎片及染色体DNA。
  7. 上清液转移至另一微离心管中，甲等体积胞和酚，混匀，12000r/min,离心2分钟。
  8. 上层水相转移至另一位离心管，加2倍量冷水乙醇，14000r/min，离心20分钟。
  9. 倾去乙醇，加入7o％冷乙醇淋洗。
  10. 倾去乙醇，滤纸吸于，真空抽吸2～3分钟。
  11. 加人50μlTE缓冲液，溶解DNA。
  12. 加入1μl核糖核酸酶(10mg／m1)，14000r/min,离心2s，使核糖核酸酶与管底液体混匀。
  13. 37℃水浴30min。
  14. 样品放一20℃冰箱保存备用。

试剂

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  • TE缓冲液(10mmol/L, Tris-HCl,1mmol/L, EDTA,pH8.0)
配制方法
Tris 1.211g
EDTA.Na 0.037g

用800ml重蒸水溶解，用分析纯盐酸调整pH至8.0，加重蒸水定容至1000ml。

  • TENS溶液：(10mmol/L, Tris-HCl, pH8.0，1mmol/L   EDTA,0.1mol/L  NaOH,0.5%SDS)
配制方法
NaOH 0.4 g
SDS 0.5 g

加80mlTE缓冲液溶解。加TE缓冲液定容至100ml.

  • 3.0mol／1醋酸钠溶液(pH5.2)
配制方法
醋酸钠 24.6g

用70ml重蒸水溶解，再用冰乙酸大约调pH至5.2,加重蒸水定容至100ml。

  • 纯净的酚使用时不需要重蒸。市售的酚一般为红色或黄色结晶体，使用之前必须重蒸，除去能引起DNA和RNA断裂和聚合的杂质。将苯酚置于65℃水浴中溶解，重新进行蒸馏，当温度升至183℃时，开始收集在若干个棕色瓶中。纯酚和重蒸酚都应贮存在-20℃使用前取一瓶重蒸酚于分液漏斗中，加入等体积的lmol／L Tris-HCI(pH8.0)缓冲液，立即加盖，激烈振荡，并加入固体Tris摇匀调pH(一般100ml苯酚约加l克固体Tris)分层后测上层水相pH至7.6一8.0。从分液漏斗中放出下层酚相于棕色瓶中，并加一定体积0.1mol／L Tris-HCI(pH8.0)覆盖在酚相上，置4℃冰箱贮存备用。酚是一种强腐蚀剂，能引起腐蚀性损伤，操作时应戴上眼镜和手套。如果皮肤上溅上了酚，应用大量水冲洗或用肥皂水冲洗。酚在空气极易氧化变红，要随时加盖，也可加入抗氧化剂0.1％β-羟基喹啉及0.2％β-巯基乙醇。
  • 无水乙醇：置-20℃冰箱中保存备用
  • 70％乙醇：置-20℃冰箱中保存备用
  • 核糖核酸酶(10mg／ml)配制方法：称取l0mg核糖核酸酶A(RNaseA，美国SIGMA或中科院上海生物化学研究所东风试剂厂)。于灭菌的微离心管内，加1 ml 100mmol／pH5.0的NaAC溶液(完全溶解)，即为10mg／ml RNase，为了破坏脱氧核糖核酸酶(DNase，置80℃水浴中10min或100℃水浴2 min，然后置一20℃(或家用冰箱的冰格内)保存。‘

材料

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菌种：大肠杆菌(pUC57)

LB液体培养基
精解蛋白胨 3g
酵母浸出粉 1.5g
氯化钠 3g
葡萄糖 0.6g

按上述配方用重蒸水(ddH2O或dH2O表示，下同)溶解至300ml。用10mol／LnaOH调pH至7.2～7.4。分装于15ml试管中，每支5ml。然后置高压蒸汽消毒锅以1.1kg／cm2灭菌20min.

抗菌素：氨苄青霉素(Amp)临用时用无菌水配制在无菌有盖试管中，浓度为100mg／m1。

仪器

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恒温振荡器。

低温冰箱-20℃

真空泵。

台式高速离心机

注意事项

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  1. 质粒DNA提取的方法很多，有碱变性法、羟基磷灰石柱层析法、溴化乙锭一氯化铯梯度超离心法等。本次实验是一种小量快速提取法。小量快速提取法也有多种，但基本原理和步骤是一致的．包括下述步骤：
    • 裂解菌体细胞；
    • 质粒和染色体DNA的分离；
    • 除去蛋白质。RNA及其他影响限制性酶活性的细胞成分；
    • 除去提玑过程中使用的去垢剂、盐等。
  2. 在基因操作实验中．保存或提取DNA过程中，一般都采用TE缓冲液，而不选用其它的缓冲液。虽然很多缓冲系统．如磷酸盐缓冲系统，硼酸系统都符合细胞内环境的生理范围，可以作为DNA的保存液，但在某些实验中，这些缓冲对会影响实验。如在转化实验中，要用到Ca+，如果川磷酸盐缓冲液，磷酸根将与Ca2+产生Ca(PO4+沉淀；在各种工具酶反应时，不同的酶对辅助因子的种类及数量要求不同，有的要求高盐离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用Tris—HCI缓冲系统，不存在金属离子的干扰作用；作中的EDTA是二价离子Mg2+、Ca2+等的螯合剂，可降低系统中的这些离子浓度，而这些离产是脱氧核糖核酸酶的辅助因子，所以EDTA可以抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的降解作用。
  3. TENS中NaOH：核酸在pH大于5,小于9的溶液中稳定，怛当pH大于12或小于3时，就会引起DNA两条链之间氢键的解离而变性。TENS中有NaOH使其pH大于12，因而使染色体DNA与质粒DNA变性。TENS中的SDS：SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有：
    • 溶解细胞膜上的脂肪与蛋白质,因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜；
    • 解聚细胞中的核蛋白；
    • SDS能与蛋白质结合成为R1一O一SO3…R2+一蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取过程中，必须把它去干净，防止在下一步操作中(用Rnase去除RNA时)受干扰。
  4. 3.0mol／L NaAC(pH5.2)使pH大于12的DNA抽提液回到中性，使变性的质粒DNA能够复性，并能稳定存在。染色体DNA不能复性(染色体DNA不存在超螺旋共价闭合环结构)  而高盐的3mol/L  NaAC有利于变性的大分子染色体DNA、RNA、以及SDS—蛋白质复合物凝聚沉淀。pH5.2也能中和核酸上的电荷，减少相互斥力而互相聚合。同时，钠盐能与SDS一蛋白质复合物作用后，形成溶解度较小的钠盐形式复合物，使沉淀更完全。
  5. 饱和酚：酚是一种表面变性剂，属非极性分子。水是极性分子。当蛋白质溶液与酚混合合时，蛋白质分子之间的水分子被酚挤走，使蛋白质失去水合状态而变性。经过离心。变性蛋白质的密度比水的密度大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，酚比重更大，保留在最下层。酚作为变性剂．也有一些缺点：
    • 酚与水有一定程度的互溶，酚相中水的溶解可达大约10％～15％，溶解在这部分水相中有DNA会损失，
    • 酚很容易氧化，变成粉红色，氧化的酚容易降解DNA，解决酚氧化和带水的办法是将酚重蒸，除去氧化的部分，再用Tris—HCl缓冲液饱和，使酚不至于夺去DNA中的水，带走部分DNA。
    • 饱和酚中加上8一羟基硅啉及巯基乙醇，防止酚氧化，还是弱的螫合剂．可抑制DNase。由于有颜色．溶解在酚中后，使酚带上颜色，便于酚相与水相的分肉，酚饱和后，表面盖上一层Tris水溶液，隔绝空气，阻止酚氧化。
  6. 关于无水乙醇沉淀DNA的说明：用无水乙醇沉淀DNA，是实验中最常用的沉淀DNA的方法。乙醇的优点是具有极性，可以以任意比例和水相混溶，乙醇与核酸不会起化学反应，对DNA很安全，因此是理想的沉淀剂。
    • 乙醇之所以能沉淀DNA，是由于DNA溶液是以水合状态稳定存在的DNA，当加入乙醇．乙醇会夺去DNA周围的水分子，使DNA失水而易于聚合沉淀，一般实验中，用2倍体积的无水乙醇与DNA相混合。使乙醇的最终含量占67％左右。由此可预见，也可用95％乙醇沉淀DNA，但是用95％乙醇使总体积增大．而DNA在醇溶液中总有一定程度的溶解。因而DNA损失也增大，影响收率。
    • 乙醇沉淀DNA溶液时，DNA溶液中应该有一定的盐浓度，中和DNA表面电荷。如果溶液中盐浓度太低，要加NaAC或NaCl至最终浓度0.1~0.25mol／l在pH 8左右的DNA溶液中，DNA分子带负电荷，加一定浓度的NaAC或NaCl使Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA钠盐沉淀。当加入的盐溶液浓度太低时。只有部分DNA形成DNA钠盐而聚合，这样就造成DNA沉淀不完全。但当加入的盐溶液浓度太高时，其效果也不好，在沉淀的DNA中，由于过多的盐杂质存在，影响DNA的酶切等反应，必须进行洗涤或重沉淀。
    • 乙醇沉淀DNA一般采用低温条件，这是由于在低温条件下．分子运动大大减少，DNA易于聚合而沉淀。为了使质粒DNA能充分沉淀，一般保存时间总是过长的，同时也要视样品的体积而异，在微量离心管中的样品要比40毫升离心管中DNA样品的量少，冷却就较迅速。

大量提取DNA时，目前习惯上常采用如下几种方法：

保存在家用冰箱结冰盒内 过夜
保存在-2℃亡冰箱内 过夜
保存在-70℃冰箱内 30mm～2h
放置干冰中（约-20℃） 30min
放置干冰加酒精中(约-70℃) 16mm
放置在液氮缸中液氮的气相内，不可以浸在液氮中(温度在-198℃左右) 5～15min

除了用乙醇外还可用1倍体积丙醇(相当于2倍体积乙醇)使DNA沉淀。用异丙醇的好处是要求离心的液体体积小，但异丙醇挥发性不如乙醇，最终除区其残留部分的难度更大。

此外，异丙醇能促使蔗糖、氯化钠等溶质与DNA一起沉淀，在-70℃时，更易发生，所以一般以乙醇沉淀为宜，除非要求液体体积很小。

影响质粒DNA提纯质量和产率因素的说明

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菌株

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质粒的宿主菌菌株的不同对质粒DNA纯化的质量和产率很大。一般最好选用enA基因突变的宿主菌，即enA-菌株，如DH5α,JMl09和XL1—Blue等。使川含野生型enA基因的菌株会影响质粒DNA的纯度。

A基因是核酸内切酶I。核酸内切酶I是一种12kDa的壁膜蛋白，受镁离子激活，可被EDTA抑制，对热敏感。双链DNA是核酸内切酶I的底物，但RNA是该酶的竞争性抑制剂．能改变酶的特异性，使其由水解产生7个碱基的寡聚核苷酸的双链DNA内切酶活性，变为平均每底物每次切割一次的切口酶活性。核酸内切酶I的功能仍不清楚，enA基因突变的菌株没有明显的表现改变，但质粒产量及稳定性明显提高。细菌不同生长期核酸内切酶I的表达水平不同。生长的指数期较稳定期核酸内切酶I水平高300倍。此外，培养基中促进快速生长的成分如高葡萄糖水及补充氨基酸都会使核酸内切酶I水平增高。

此外，菌株的其他性质有时也应加以考虑。如XL1—Blue生长速度较慢。,HBl01及其衍生菌株如TG1及JMl00序列，含大量的糖，这些糖如果在质粒纯化过程中不除去，在菌体裂解后释放出来，可能抑制酶活性。

质粒的拷贝数

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细菌中质粒的拷贝数是影响质粒产量的最主要的因素。质粒的拷贝数主要由复制起点(replication origin)如pMBl及pSC101及其附近的DNA序列决定。这些被称作复制点的区域通过细菌的酶复合物控制质粒DNA的复制。当插进一些特殊的载体时，能降低质粒的拷贝数。此外，太大的DNA插入也能使质粒拷贝数下降。一些质粒，如pUC序列，由于经过了突变和改造，在细菌细胞内的拷贝数很大．以pBR322质粒为基础的质粒拷贝数较低，粘粒(cosmid)及特别大的质粒通常拷贝数极低。

各种质粒和粘粒的复制起点和拷贝数
载体 复制起点 拷贝数 特点
质粒 pUC 载体 ColE1 500～700 高拷贝
pBluescript 载体 ColE1 300～500 高拷贝
pGEM 载体 pMB1 300～400 高拷贝
pTZ 载体 pMB1 >1000 高拷贝
pBR322 及其衍生质粒 pMB1 15～20 低拷贝
pACYC 及其衍生质粒 p15A 10～12 低拷贝
psc101 及其衍生质粒 psc101 ～5 极低拷贝
粘粒 SuperCos ColE1 10～20 低拷贝
PWE15 ColE1 10～20 低拷贝

细菌培养

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用于制备质粒的细菌培养应该从选择性培养的平板中挑取单个菌落培养。不应该直接从甘油保存菌，半固体培养基及液体培养基中挑菌，这可能导致质粒丢失。也不该从长期保存的平板上直接挑菌，这也可能使质粒突变或使质粒丢失。挑取单个菌落至3ml选择性培养基中，培养至饱和状态(12～14小时)就可进行小量质粒提取。

试剂盒提取方法

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除了本实验采用的小量质粒DNA提取法外，很多生物试剂公司还提供试剂盒用于小量质粒DNA的提取。通常情况下．采用试剂盒都能获得较高质量的DNA，所得到的DNA都可直接用于传染、测序及限制酶分析等。下面介绍三种试剂盒。

用Bio-Rad质粒小量制备试剂盒提取质粒DNA

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  1. 取过夜培养的菌液l～2ml至微离心管中。离心30s沉淀细胞，吸去所有上清。
  2. 加200μl细胞悬浮液(Cell Rcsuspension Solution) 并吹打数次(或旋涡振荡)，使沉淀完全悬浮。
  3. 加250μl细胞裂解液(Cell Lysis Solution)，轻轻颠倒管l0次(不旋涡振荡)如果细胞裂解了，溶液应变得粘稠且稍清亮。如果仍然浑浊，继续混合。
  4. 加250μl中和液(Neuralization Solution)，轻轻颠倒管10次(不旋涡振荡)混合(此时应该形成可见沉淀)。
  5. 在微离心机上以最高转速(12 000～14 000g)沉淀细胞碎片5min。在管底或沿着管壁有紧密白色沉淀。
  6. 将一支过滤柱(Spin Filter)插在一支新离心管上。
  7. 直接吸200μl基质悬液(Quantum Prep Matrix)到含白色沉淀的管中(吸基质中成份前，彻底混合基质)，为避免管壁有沉淀，吹吸2次混合，立即直接将悬液倒在过滤柱(Spin Filter)内，当所有样品转移到过滤柱内后，离心30s。
  8. 从微离心管上移开过滤柱，弃去离心管底的滤液。
  9. 再放过滤柱到同一管上。加500μl洗涤液(Wash Solution)洗涤基质(第一次使用前加63ml 95％乙醇到洗涤液中)，离心30s。
  10. 从微离心管上移开过滤柱，弃去离心管底的滤液，再放过滤柱到同一管上。
  11. 加500μl洗涤液洗涤基质，离心2nun，除去残存的乙醇。移开过滤柱，弃去离心管。
  12. 放过滤柱在一新离心管上，加100μl去离子水或TE，离心30s洗脱DNA。弃去过滤柱，将洗脱的DNA保存在-20℃。

用泛特津公司的日常型质粒DNA小量制备试剂盒提取质粒DNA

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  1. 取5ml过夜培养的菌液，用台式离心机最高速度离心lmin，弃尽上清。
  2. 加入250μlS1溶液悬浮细菌，加入250山S2溶液，混和但充分地上下混合均匀3～4次。
  3. 加400μl 4℃预冷的S3溶液，温和但充分地上下混合均匀．静置2min。
  4. 将溶液连同凝结块一起转入到微量滤器中，1000r／min离心30s，使溶液直接过滤到2ml离心管中。
  5. 将过滤液从2ml离心管中转入到DNA小量制备管中，3600r／min离心lmin。
  6. 弃2ml离心管中溶液．将DNA小量制备管重新置回到2ml离心管中。
  7. 加500μl W1溶液，3600r／min离心1min，弃2ml离心管中溶液，将DNA小量制备管重新置回到2ml离心管中。
  8. 加650μl S5溶液，3600r／min离心lmin。
  9. 将DNA制备管移人另一2ml离心管中，再加650μl S5溶液，1200r／min离心2min。
  10. 将小量制备管移到1.5ml离心管上，加60μl 65℃预热的TE缓冲液于DNA结合膜中间，室温下置lmin，1200r／min,离心1min,洗脱质粒DNA。

用Qiegan质粒DNA小量制备试剂盒(P1asmid Mini Kit)提取质粒DNA

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试剂盒组成
质粒提取试剂盒(Plasmid Kits) 小量25次（Mini 25） 小量100次（mini 100）
厂家目录号(Catalog No.) 12123 12125
纯化柱(QIAGEN—tip 20) 25 100
Pl缓冲液(Buffer，P1) 20ml 40ml
P2缓冲液(Buffer，P2)  20ml 40ml
P3缓冲液(Buffer, P3)  20ml 40ml
QBT缓冲液(Buffer QBT) 40ml 110ml
QC缓冲液(Buffer QC)   120ml 480ml
QF缓冲液(Buffer QF) 30ml 110ml
RNase A(100mg／ml) 2mg 4mg
使用手册(Handbook)  1 1

实验步骤

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  1. 取3nd过夜培养的菌液，用台式离心机最高速度离心,弃去上清。沉淀用0.3ml含Rnase A的P1缓冲液(Buffer P1)溶解。注：P1缓冲液在使用前应该加人试剂盒中提供的RNase A溶液．Rnase A溶液加入P1缓冲液前．可先短时高速离心至管底。含Rnase A的P1缓冲液可于2～8℃保存6个月．
  2. 加0.3m1 P2缓冲液(Buffer P2)，轻轻颠倒管4～6次混匀(不要旋涡振荡)，室温放
  3. 置5 min。注：裂解反应时间不要大干5 min。P2缓冲液开盖取完试剂后．立即重新；旋上盖子．以免试剂中的NaOH与空气中的CO2反应。
  4. 加0.3ml预冷的P3缓冲液(Buffer P3)，立即轻轻颠倒管
  5. 再次混匀样品，在台式离心机上以最大转速(10 000—13 0OOr/ min或14 000～18 000r/ min)离心10 min，移出上清，注：离心后，上清应该时清亮的．如果上清不清亮，再次离心至上清清亮，不清亮的成分将堵塞柱子，使流速清亮。
  6. 用lml QBT缓冲液(Buffer QBT)平衡QIAGEN—tip 20，让补上液体自然(以重力)流干。
  7. 向QIAGEN-tip 20柱上加入步4收集的上清，让上清自然(以重力)流人柱中。上清尽快加人到柱中．如果存放时间太久．由于蛋白质沉淀变混，上样前应重新离心，以免堵塞柱
  8. 用4 X 1ml，缓冲液(Buffer QC)洗涤QIAGEN—tip 20柱。    ‘
  9. 用O.8ml缓冲液(Buffer QF)洗脱DNA。
  10. 用0.7体积(0.8ml 洗脱流出液则为0.56ml)室温放置的异丙醇沉淀离心机上≥10 000r／min离心30 min，小心倒出上清。
  11. 用1ml 70％乙醇洗涤DNA，空气干燥5 min，以适当体积缓冲液重新溶解DNA。

试剂

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  1. P1缓冲液(菌体重悬缓冲液)：50mmol／l Tris-HCl，pH8.0;10mmol／L EDTA；100／μg／ml RnaseA 4℃保存。
    • 配制方法：Tris 6.06 g，EDTA·2H2O 3.72 g，用800ml ddH2O溶解，用HCl调pH至8.0加ddH2O至1000 ml。1000 ml P1缓冲液中加入100 mg RNaseA。
  2. P2缓冲液(裂解缓冲液)：200mmol／L NaOH，1％SDS。室温保存。
    • 配制方法：NaOH 8.0g溶于950ml ddH2O中，加入50 ml 20%SDS溶液加ddH2O至1000 ml。
  3. P3缓冲液(中和缓冲液)：3.0mmo]／L乙酸钾，pH5．5。室温或4℃保存
    • 配制方法：乙酸钾294.5g溶于500 ml ddH3O中，用冰乙酸(约110m1)调pH至5.5 加ddH2O至1000 ml。
  4. QBT缓冲液(平衡缓冲液)：750mmol／L NaCl; 50mmol／L MOPS，pH7.O;15％异丙醇；0.15％Triton X—100。室温保存。
    • 配制方法：NaCl 43.83g，MOPS(自由酸)10.46g溶于860ml ddH2O。调pH至7.0。加150 ml纯异丙醇及15 ml lO％ TritonX—100溶液，加ddH2O至1000ml。
  5. QC缓冲液(冲洗缓冲液)：1.0mmol／L NaCl；50mmol／L MOPS，pH7.0；15％异丙醇。室温保存。  
    • 配制方法：NaCl 58.44g；MOPS(自由酸)10.46g溶于800 ml ddH2O 。调pH7.0。加150ml纯异丙醇，加ddH2O至1000ml。
  6. QF缓冲液(洗脱缓冲液)：1.25mol／L NaCl；50mmol／L Tris HCl，pH8.5；15％异丙醇。室温保存。
    • 配制方法：NaCl 73．05g，Tris 6．06g，溶于800ml ddH2O。用HCl凋pH至8.5。加150ml纯异丙醇，加ddH2O至1000ml。
  7. TE：10mmol／L Tris-HCl，pH8.O，1mmol／L EDTA。室温保存。
  8. STE：100mmol／L NaCl，10mmol／L Tris-HCl，pH8.0，1mmol／L EDTA。室温保存。
    • 配制方法：NaCl 5.84g，Tris 1.21g，EDTA·2H2O 0.37g，溶于800ml ddH20中，用HCl调pH8.0，加ddH2O至1000ml。
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