生物化學與分子生物學/其他實驗技術/農桿菌感受態細胞的製備與轉化

實驗原理

在利用根癌農桿菌介導的基因轉化中，首先要獲得含有目的基因的農桿菌工程菌株。

在基因工程操作中，感受態細胞的製備和質粒的轉化是一項基本技術。感受態是細菌細胞具有的能夠接受外源DNA的一種特殊生理狀態。農桿菌的感受態可用CaCl2處理而誘導產生。將正在生長的農桿菌細胞加入到低滲的CaCl2溶液中，0℃下處理便會使細菌細胞膜的透性發生改變，此時的細胞呈現出感受態。製備好的農桿菌感受態細胞迅速冷凍於-70℃可保存相當一段時間而不會對其轉化效率有太大的影響。

實驗儀器、材料和試劑

1. 儀器：超淨工作檯，恆溫搖床，冷凍高速離心機，高壓滅菌鍋，冰箱，-70℃超低溫冰櫃，分光光度計，接種針，10ml試管，50ml離心管，1.5ml離心管，冰浴，微量進樣器及吸頭。以上玻璃儀器和離心管需在用前滅菌，滅菌條件：120℃，15分鐘。
2. 材料：土壤農桿菌LBA4404菌株或其它農桿菌菌株
3. 試劑：YEB液體培養基（1L）：酵母提取物1g，牛肉膏5g，蛋白腖5g，蔗糖5g，MgSO4·7H2O 0.5g，pH7.0，高壓滅菌。

利福平（Rif）儲液：50mg/ml

20mM CaCl2，高壓滅菌。

實驗步驟

1. 挑取根癌農桿菌LBA4404單菌落於3ml的YEB液體培養基（含Rif 50mg/l）中，28℃振盪培養過夜；
2. 取過夜培養菌液1ml接種於50mlYEB（Rif 50mg/l）液體培養基中，28℃振盪培養至OD600為0.5；
3. 取2ml菌液，13000rpm，離心30sec, 棄上清；
4. 加入1000µl 20mM CaCl2，使農桿菌細胞充分懸浮，冰浴30min；
5. 13000rpm，離心30sec，棄上清，置於冰上，加入500µl預冷的20mM CaCl2，充分懸浮細胞，冰浴中保存，24hr內使用，或液氮中速凍1min，置-70℃保存備用。

質粒DNA直接導入農桿菌

實驗原理

在低溫下，外源DNA（質粒）可吸附到感受態細胞表面，誘導細胞吸收DNA。（加入熱激原理）轉化了質粒DNA的農桿菌隨後28℃恢復培養，可使質粒上攜帶的編碼抗生素的抗性基因得到表達，因此，轉化了質粒的農桿菌細胞可在含有相應抗生素的培養基上生長，而沒有轉化的細胞則無法生長。

實驗儀器、材料和試劑

1. 儀器：超淨工作檯，恆溫搖床，培養箱，台式離心機，水浴鍋，高壓滅菌鍋，-70℃超低溫冰箱，培養皿，微量進樣器及吸頭。
2. 材料：根癌農桿菌LBA4404（或EHA105）感受態細胞，質粒pCAMBAI1300+SPR植物表達載體
3. 試劑：液氮
   • YEB液體培養基（1L）：酵母提取物1g，牛肉膏5g，蛋白腖5g，蔗糖5g，MgSO4•7H2O 0.5g，pH7.0，高壓滅菌。
   • YEB固體培養基：每升YEB液體培養基加15g瓊脂粉，高壓滅菌。
   • 卡那黴素（Kan）儲液：50mg/ml
   • 利福平（Rif）儲液：50mg/ml
   • YEB固體培養基平板（Kan抗性）：滅菌後的YEB固體培養基待其溫度降至50℃時加入卡那黴素（Kan）和利福平（Rif），至終濃度分別為100µg/ml和50µg/ml，混勻後立即倒入培養皿，凝固後4℃倒置保存。

實驗步驟

1. 在200µl感受態細胞中加入2－6µl質粒（pBI121）DNA，冰浴5min，液氮中速凍5min；
2. 迅速轉入37℃水浴中，熱激5min；
3. 加入1ml YEB液體培養基，28℃慢速振盪培養2－4小時；
4. 3000rpm離心4min，去一部分上清，留取200µl菌液塗布於含有50µg/ml Kan和50µg/ml Rif的YEB平板；
5. 放置約0.5h，待水份干後，28℃培養約24小時至長出菌落。

農桿菌轉化子的鑑定

實驗原理

經改造的Ti質粒（只含有幫助T-DNA跳到植物染色體上的Vir區）存在於農桿菌工程菌株中，含有T-DNA的雙元載體（Binory Vectors）完成重組後可以在大腸桿菌中擴增，再轉入農桿菌中。從抗性培養基上篩選得到的農桿菌轉化子中應攜帶轉入的重組質粒，而對照菌株則沒有。

鹼裂解法是一種應用最為廣泛的質粒DNA提取方法，該法用於從小量培養物中抽提質粒DNA，比較方便、省時，提取的DNA質量較高，可用於DNA的酶切、PCR甚至測序。提取質粒DNA是基於染色體DNA與質粒DNA的變性與復性的差異而使其分離。當細胞在NaOH 和SDS溶液中裂解時，在pH高達12.6的鹼性條件下，蛋白質和染色體DNA發生變性，染色體DNA的氫鍵斷裂、雙螺旋結構解開，而質粒DNA雖大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價閉合環狀結構的兩條互補鏈不會完全分離，當加入中和液醋酸鉀或醋酸鈉高鹽緩衝液時，質粒DNA恢復原來的構型，而染色體DNA不能復性，形成纏繞的網狀結構，通過離心，染色體DNA、蛋白質-SDS複合物隨細胞碎片等沉澱下來，質粒DNA則留在上清中。

實驗儀器、材料和試劑

1. 儀器：台式高速離心機，高壓滅菌鍋，恆溫搖床，恆溫水浴，電泳儀及電泳槽，紫外燈，加樣器（pipettor），小離心管（eppendorf tube），吸頭（tip），三角瓶，牙籤。
2. 材料：含質粒的農桿菌LBA4404（或EHA105），農桿菌LBA4404或EHA105）
3. 試劑：YEB液體培養基（1L）：酵母提取物1g，牛肉膏5g，蛋白腖5g，蔗糖5g，MgSO4·7H2O 0.5g，pH7.0，高壓滅菌。

溶液Ⅰ：50mmol/L 葡萄糖

25mmol/L Tris-HCl（pH8.0）

10mmol/L EDTA（pH8.0），高壓滅菌（6.895×104Pa），4℃保存

溶液Ⅱ：0.2mol/L NaOH，1％ SDS

先分別配成濃度0.4M NaOH（滅菌）及2％ SDS，用前等體積混合。

溶液Ⅲ：3mol/L NaAc/KAc（pH4.8）10

5mol/L NaAc/KAc 60ml（滅菌）

HAc 11.5ml

H2O 28.5ml（滅菌），三者混合

EB：貯液濃度為10mg/mL，工作濃度為0.5µg/ml

TAE：40mmol/L Tris-HAc，2mmol/L EDTA，pH8.0，Tris飽和酚、氯仿、無水乙醇、RNase A

實驗步驟

質粒DNA的提取

1. 挑取一個單菌落接種於3ml含相應抗生素的YEB（50mg/L Km）液體培養基中，28℃劇烈振盪過夜；
2. 收集1.5ml過夜培養物於1.5ml離心管中，10000rpm離心30sec收集菌體，儘可能除盡培養基；
3. 向細胞沉澱中加入100µl 預冷的溶液Ⅰ，劇烈振盪，使菌體充分懸浮；
4. 加入200μl 溶液Ⅱ，立即溫和顛倒離心管4-10次，避免劇烈振盪；
5. 加入150μl 溶液Ⅲ，溫和顛倒離心管4-10次，將離心管置冰浴5min；
6. 於室溫12000g離心15min，將上清液轉入新的離心管中（儘量避免吸取沉澱）；
7. 加入0.6倍體積的異丙醇，顛倒混勻；
8. 12000g離心10min，棄上清液，加入400μl 70%乙醇，12000g離心8min，棄上清，在真空抽乾或在超淨工作檯中吹乾；
9. 加入10µl含20µg/ml RNase A的TE或重蒸水溶解DNA，37°C溫育30min；
10. -20℃保存。

用瓊脂糖電泳檢測質粒DNA（或用PCR進行檢測）

用1×TAE配製0.8％的瓊脂糖凝膠，取所提取的質粒DNA溶液2-5µl進行電泳，50-100v約0.5-1hr，紫外燈下觀察結果。

煙草遺傳轉化實驗

實驗器材

搖床、超淨工作檯、冰箱、移液搶、鑷子、手術刀、打孔器、酒精燈、棉球、培養皿、三角瓶、濾紙、牛皮紙、牙籤。

實驗藥品

MS培養基母液、NaCl、酵母、水解酪蛋白、瓊脂、蔗糖、卡那黴素、羧卞青黴素、無菌水、6-BA、NAA、0.1%升汞、70%乙醇。

煙草愈傷誘導或分化培養基：MS＋6-BA(1.0 mg/L )+NAA(1.0mg/L)

煙草生根培養基：MS+ NAA(0.1mg/L)

煙草選擇培養基：MS＋6-BA(1.0 mg/L )+NAA(1.0mg/L)+75mg/L Km+500mg/L羧卞青黴素（Cb）

實驗步驟

受體材料的準備與預培養

1. 取自田間栽培煙草植株，用蒸餾水沖洗1遍後，以70%乙醇清洗45s，再以0.1%的升汞消毒6-8min，無菌水沖洗5遍，無菌濾紙吸乾水分。
2. 用滅過菌的打孔器將無菌煙草葉片鑿成6mm的葉盤（或用手術刀切成5－10mm方形葉片。
3. 將葉盤或葉片接種在煙草愈傷組織誘導或分化培養基上進行預培養，預培養2－3天，材料切口處剛剛開始彭大時備用。

根癌農桿菌培養

1. 從平板上挑取單菌落，接種到20mL附加相應抗生素（卡那黴素）的YEB液體培養基中，在恆溫搖床上，於28℃下以180r/min培養至OD600為0.6~0.8（約需17h）。
2. OD600為0.6~0.8的菌液，按1%~2%的比例，轉入新配製的無抗生素的YEB液體培養基中，可同時加入100~500µmol/L的乙醯丁香酮。在上述相同的條件下再培養6h左右，待OD600為0.2~0.5時即可用於轉化。

浸染

在超淨工作檯上，將菌液倒入無菌三角瓶中，從培養瓶中取出預培養過的外植體，放入菌液中，浸泡適當時間（5~30min）。取出外植體置於無菌濾紙上吸去附着的菌液。

共培養

將浸染過的外植體接種在煙草愈傷組織誘導或分化培養基上，在28℃暗培養條件下共培養2~4天。

選擇培養

將經過共培養的外植體移到加有選擇壓的煙草愈傷組織誘導或分化培養基（附加500mg/L的羧苄青黴素，抑制根癌農標菌生長）上，在光照為2000~10000lx、25℃條件下進行選擇培養。

繼代選擇培養

選擇培養2－3周後，外植體的轉化細胞將分化出抗性不定芽或產生抗性愈傷組織，將這些抗性材料轉入相相應的選擇培養基中進行繼代擴繁培養，或轉入附加選擇壓的生長或分化培養基中使其生長或誘導生化。

生根培養

待不定芽長到1cm以上時，切下並插入含有選擇壓的煙草生根培養基上進行生根培養，兩周左右長出不定根。

附YEP可用LB培養基替代，配方如下：

LB固體培養基和LB液體培養基

酵母提取物(yeast Ext)              5g/L

蛋白凍(peptone)                   10g/L

NaCl                        10g/L

液體LB培養基不含瓊脂，供搖床培養農桿菌，含0.5%瓊脂的固體供短期保存菌種用。(pH7.0-7.2)