生物化學與分子生物學/其他實驗技術/染色質免疫共沉澱(ChIP)實驗

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染色質免疫共沉澱簡介[編輯]

真核生物的基因組DNA以染色質的形式存在。因此,研究蛋白質與DNA在染色質環境下的相互作用是闡明真核生物基因表達機制的基本途徑。染色質免疫沉澱技術(chromatin immunoprecipitation assay, CHIP)是目前唯一研究體內DNA與蛋白質相互作用的方法。它的基本原理是在活細胞狀態下固定蛋白質-DNA複合物,並將其隨機切斷為一定長度範圍內的染色質小片段,然後通過免疫學方法沉澱此複合體,特異性地富集目的蛋白結合的DNA片段,通過對目的片斷的純化與檢測,從而獲得蛋白質與DNA相互作用的信息。CHIP不僅可以檢測體內反式因子與DNA的動態作用,還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾與基因表達的關係。而且,CHIP與其他方法的結合,擴大了其應用範圍:CHIP與基因芯片相結合建立的CHIP-on-chip方法已廣泛用於特定反式因子靶基因的高通量篩選;CHIP與體內足跡法相結合,用於尋找反式因子的體內結合位點;RNA-CHIP用於研究RNA在基因表達調控中的作用。由此可見,隨着CHIP的進一步完善,它必將會在基因表達調控研究中發揮越來越重要的作用。

染色質免疫共沉澱可以:

  1. 組蛋白修飾酶的抗體作為「生物標記」;
  2. 轉錄調控分析;
  3. 藥物開發研究;
  4. DNA損失與凋亡分析。

ChIP的一般流程[編輯]

甲醛處理細胞---收集細胞,超聲破碎---加入目的蛋白的抗體,與靶蛋白-DNA複合物相互結合---加入ProteinA,結合抗體-靶蛋白-DNA複合物,並沉澱---對沉澱下來的複合物進行清洗,除去一些非特異性結合---洗脫,得到富集的靶蛋白-DNA複合物---解交聯,純化富集的DNA-片斷---PCR分析。

實驗方法原理[編輯]

在保持組蛋白和DNA聯合的同時,通過運用對應於一個特定組蛋白標記的生物抗體,染色質被切成很小的片斷,並沉澱下來。

IP是利用抗原蛋白質和抗體的特異性結合以及細菌蛋白質的「prorein A」特異性地結合到免疫球蛋白的FC片段的現象活用開發出來的方法。

目前多用精製的prorein A預先結合固化在argarose的beads上,使之與含有抗原的溶液及抗體反應後,beads上的prorein A就能吸附抗原達到精製的目的。

實驗材料、試劑、儀器耗材[編輯]

  • 細胞樣品
  • 甲醛、甘氨酸、PBS、SDS、 Lysis Buffer、洗脫液、RNaseA、蛋白酶K、omega膠回收試劑盒等
  • 離心管、超聲儀、電泳儀、離心機等

實驗步驟[編輯]

細胞的甲醛交聯與超聲破碎( 第一天)[編輯]

  1. 取出1平皿細胞(10 cm平皿),加入243 ul 37%甲醛,使得甲醛的終濃度為1%(培養基共有9 ml)。
  2. 37℃孵育10 min。
  3. 終止交聯:加甘氨酸至終濃度為0.125 M。450 ul 2.5 M甘氨酸於平皿中。混勻後,在室溫下放置5 min即可。
  4. 吸盡培養基,用冰冷的PBS清洗細胞2次。
  5. 細胞刮刀收集細胞於15 ml離心管中(PBS依次為5 ml,3 ml和3 ml)。預冷後2 000 rpm 5 min收集細胞。
  6. 倒去上清。按照細胞量,加入SDS Lysis Buffer。使得細胞終濃度為每200ul含2×106個細胞。這樣每100 ul溶液含1×106個細胞。再加入蛋白酶抑制劑複合物。假設MCF7長滿板為5×106個細胞。本次細胞長得約為80%。即為4×106個細胞。因此每管加入400 ul SDS Lysis Buffer。將2管混在一起,共800 ul。
  7. 超聲破碎:VCX750,25%功率,4.5 s衝擊,9 s間隙。共14次。

除雜及抗體哺育 ( 第一天)[編輯]

  1. 超聲破碎結束後,10 000 g 4℃離心10 min。去除不溶物質。
  2. 留取300ul做實驗,其餘保存於-80℃。
  3. 300 ul中,100 ul加抗體做為實驗組;100 ul不加抗體做為對照組;100 ul加入4 ul 5 M NaCl(NaCl終濃度為0.2 M),65℃處理3 h解交聯,跑電泳,檢測超聲破碎的效果。
  4. 在100 ul的超聲破碎產物中,加入900 ul ChIP DilutionBuffer和20 ul的50×PIC。
  5. 再各加入60 ul ProteinA Agarose/SalmonSpermDNA。4℃顛轉混勻1 h。
  6. 1 h後,在4℃靜置10 min沉澱,700 rpm離心1 min。
  7. 取上清。各留取20 ul做為input。一管中加入1 ul抗體,另一管中則不加抗體。4℃顛轉過夜。

檢驗超聲破碎的效果 ( 第一天)[編輯]

  1. 取100 ul超聲破碎後產物,加入4 ul 5M NaCl,65℃處理2 h解交聯。
  2. 分出一半用酚/氯仿抽提。電泳檢測超聲效果。

免疫複合物的沉澱及清洗( 第二天)[編輯]

1. 孵育過夜後,每管中加入60 ul ProteinA Agarose/SalmonSperm DNA。4℃顛轉2 h。

2. 4℃靜置10 min後,700 rpm離心1 min。除去上清。

3. 依次用下列溶液清洗沉澱複合物。清洗的步驟:加入溶液,在4℃顛轉10 min,4℃靜置10 min沉澱,700 rpm離心1 min,除去上清。

洗滌溶液:

(1)low salt wash buffer-one wash

(2)highsalt wash buffer-one wash

(3)LiCl wash buffer-one wash

(4)TE buffer-two wash

4. 清洗完畢後,開始洗脫。

洗脫液的配方:100 ul 10%SDS,100 ul1M NaHCO3,800 ul ddH2O,共1 ml。

每管加入250 ul洗脫buffer,室溫下顛轉15 min,靜置離心後,收集上清。重複洗滌一次。最終的洗脫液為每管500 ul。

5. 解交聯:每管中加入20 ul 5M NaCl(NaCl終濃度為0.2 M)。

6. 混勻,65℃解交聯過夜。

DNA樣品的回收(第三天)[編輯]

  1. 解交聯結束後,每管加入1 ul RNaseA(MBI),37℃孵育1 h。
  2. 每管加入10 ul 0.5 M EDTA,20 ul1M Tris.HCl(PH6.5),2 ul 10 mg/ml蛋白酶K。45℃處理2 h。
  3. DNA片段的回收----omega膠回收試劑盒。最終的樣品溶於100 ul ddH2O。

PCR分析(第三天)[編輯]

ChIP-chip技術對於大規模挖掘順式調控信息成績卓著,同時它可以用於胚胎幹細胞和一些疾病如癌症、心血管疾病和中央神經紊亂的發生的機制。研究人員還可以利用這項技術開發一些治療方法。目前ChIP-chip技術研究主要集中於兩個領域:及轉錄因子的結合和條件特異性;組蛋白的修飾,組蛋白修飾蛋白和染色體重建。

ChIP-chip在描述轉錄結合因子動力學中的研究、染色體結構組分的分布、在組蛋白的修飾、組蛋白修飾蛋白和染色體重建中的應用也十分廣泛。ChIP-chip 技術的優點是,可以在體內進行反應;在給定的檢驗細胞環境的模式下得到DNA相互關係的簡單影像;使用特異性修正抗體鑑定與包含有一個特異性後轉錄修正的蛋白質的相關位點;直接或者間接(通過蛋白質與蛋白質的相互作用)的鑑別基因組與蛋白質的相關位點。缺點是:需要一個特異性蛋白質抗體,有時難於獲得;為了獲得高豐度的結合片段,必須實驗演示胞內條件下靶標蛋白質的表達情況;調控蛋白質的基因的獲取可能需要限制在組織來源中。

總之,ChIP-chip 技術的發展為析活細胞或組織中DNA與蛋白質的相互關係提供了一個極為有力的工具。在未來的研究中,將對芯片的構建進行改進,提高其實用性。使用易於獲得抗體,增加這種方法的可用性。

在PCR分析這一塊,比較傳統的做法是半定量-PCR。但是現在隨着熒光定量PCR的普及,大家也越來越傾向於Q-PCR了。此外還有一些由ChIP衍生出來的方法。例如RIP(其實就是用ChIP的方法研究細胞內蛋白與RNA的相互結合,具體方法和ChIP差不多,只是實驗過程中要注意防止RNase,最後分析的時候需要先將RNA逆轉錄成為cDNA);還有ChIP-chip(其實就是ChIP富集得到的DNA-片段,拿去做芯片分析,做法在ChIP的基礎上有所改變,不同的公司有不同的做法,要根據公司的要求來準備樣品)。

注意事項:[編輯]

  1. 注意抗體的性質。抗體不同和抗原結合能力也不同,免染能結合未必能用在IP反應。建議仔細檢查抗體的說明書。特別是多抗的特異性是問題。
  2. 注意溶解抗原的緩衝液的性質。多數的抗原是細胞構成的蛋白,特別是骨架蛋白,緩衝液必須要使其溶解。為此,必須使用含有強界面活性劑的緩衝液,儘管它有可能影響一部分抗原抗體的結合。另一面,如用弱界面活性劑溶解細胞,就不能充分溶解細胞蛋白。即便溶解也產生與其它的蛋白結合的結果,抗原決定族被封閉,影響與抗體的結合,即使IP成功,也是很多蛋白與抗體共沉的悲慘結果。
  3. 為防止蛋白的分解,修飾,溶解抗原的緩衝液必須加蛋白每抑制劑,低溫下進行實驗。每次實驗之前,首先考慮抗體/緩衝液的比例。抗體過少就不能檢出抗原,過多則就不能沉降在beads上,殘存在上清。緩衝劑太少則不能溶解抗原,過多則抗原被稀釋。