生物化學與分子生物學/其他實驗技術/IPTG誘導蛋白表達的原理及方法步驟

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E.coli的乳糖操縱子(元)含Z、Y及A三個結構基因,分別編碼半乳糖苷酶、透酶和乙醯基轉移酶,此外還有一個操縱序列O、一個啟動序列P及一個調節基因I。I基因編碼一種阻遏蛋白,後者與O序列結合,使操縱子(元)受阻遏而處於關閉狀態。在啟動序列P上游還有一個分解(代謝)物基因激活蛋白(CAP)結合位點。由P序列、O序列和CAP結合位點共同構成lac操縱子的調控區,三個酶的編碼基因即由同一調控區調節,實現基因產物的協調表達 。在沒有乳糖存在時,lac操縱子(元)處於阻遏狀態。此時,I序列在PI啟動序列操縱下表達的Lac阻遏蛋白與O序列結合,阻礙RNA聚合酶與P序列結合,抑制轉錄起動。當有乳糖存在時,lac操縱子(元)即可被誘導。在這個操縱子(元)體系中,真正的誘導劑並非乳糖本身。乳糖進入細胞,經b-半乳糖苷酶催化,轉變為半乳糖。後者作為一種誘導劑分子結合阻遏蛋白,使蛋白構象變化,導致阻遏蛋白與O序列解離、發生轉錄。異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一種作用極強的誘導劑,不被細菌代謝而十分穩定,因此被實驗室廣泛應用。

材料[編輯]

誘導表達材料[編輯]

  • LB (Luria—Bertani))培養基

酵母膏 (Yeast extract) 5g 蛋白腖 (Peptone) 10g

NaCl 10g 瓊脂 (Agar) 1-2%

蒸餾水 (Distilled water) 1000ml pH 7.0

適用範圍:大腸桿菌

  • IPTG 貯備液:2 g IPTG溶於10 mL 蒸餾水中,0 . 22 μm 濾膜過濾除菌,分裝成1 mL /份,-20 ℃ 保存。
  • l× 凝膠電泳加樣緩衝液:

50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 )

50 mmol / L DTT

2 % SDS (電泳級)

0.1 % 溴酚藍

10 % 甘油

大腸桿菌包涵體的分離與蛋白純化材料[編輯]

酶溶法[編輯]

  • 裂解緩衝液:

50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 )

1 mmol / L EDTA

100 mmol / LNaCI

  • 50 mmol / L 苯甲基磺醯氟(PMSF )。
  • 10 mg / mL 溶菌酶。
  • 脫氧膽酸。
  • 1 mg / mL DNase I。

超聲破碎法[編輯]

  • TE 緩衝液。
  • 2×SDS -PAGE 凝膠電泳加樣緩衝液:

100 mmol / L Tris-HCI ( pH 8 . 0 )

100 mmol / L DTT

4 %SDS

0.2 % 溴酚藍

20 % 甘油

實驗方案[編輯]

外源基因的誘導表達[編輯]

  1. 用適當的限制性內切核酸酶消化載體DNA 和目的基因。
  2. 按連接步驟連接目的基因和載體,並轉化到相應的宿主菌。
  3. 篩選出含重組子的轉化菌落,提取質粒DNA 作限制性內切核酸酶圖譜,DNA 序列測定,確定無誤後進行下一步。
  4. 如果表達載體的原核啟動子為PL 啟動子,則在30 -32 ℃ 培養數小時,使培養液的OD600達0.4-0.6 ,迅速使溫度升至42 ℃ 繼續培養3 -5h ;如果表達載體的原核啟動子為tac 等,則37 ℃培養細菌數小時達到對數生長期後加IPTG 至終濃度為1 mmol / L。繼續培養3 -5h 。
  5. 取上述培養液1 mL , 1000g 離心,1 min ,沉澱,加100 μL 聚丙烯醯胺凝膠電泳上樣緩衝液後,作SDS -PAGE 檢測。

大腸桿菌包涵體的分離與蛋白質純化[編輯]

細菌的裂解[編輯]

常用方法有:① 高溫珠磨法;② 高壓勻漿;③ 超聲破碎法;④ 酶溶法;⑤ 化學滲透等。前三種方法屬機械破碎法,並且方法① 、② 已在工業生產中得到應用,後三種方法在實驗室研究中應用較為廣泛。下面介紹酶溶法和超聲破碎法的實驗步驟。

  • 酶溶法。常用的溶解酶有溶菌酶;β-1,3 -葡聚糖酶;β-1,6 -葡聚糖酶;蛋白酶;殼多糖酶;糖昔酶等。溶菌酶主要對細菌類有作用,而其他幾種酶對酵母作用顯著。主要步驟為:
  • ① 4 ℃ ,5000rpm 離心,15 min ,收集誘導表達的細菌培養液(100 mL )。棄上清,約每克濕菌加3 mL 裂解緩衝液,懸浮沉澱。