生物化學與分子生物學/基因結構分析

基因結構功能分析和疾病相關基因鑑定克隆 - 基因結構分析 - 基因功能研究 - 疾病相關基因鑑定和克隆原則 - 疾病相關基因鑑定克隆的策略和方法
大部分基因實質上就是一段特定的DNA序列，通常由編碼序列和非編碼序列組成。本節主要介紹分析基因編碼序列和兩種非編碼序列（轉錄起點和啟動子）的技術、分析基因拷貝數和基因表達產物的常用技術。

鑑定基因的順式元件是了解基因表達的關鍵

對基因結構的了解，除獲得DNA的核苷酸序列外，還必須確定基因功能區域，這些功能區域包括基因編碼區、啟動子區和轉錄起始點等順式作用元件區域。

編碼序列的確定主要通過生物信息學、cDNA文庫和RNA剪接分析法

編碼序列是對應着成熟mRNA的核苷酸序列，分析基因編碼序列的主要技術如下。
1、用數據庫分析基因編碼序列 在基因數據庫中，對各種方法所獲得的cDNA片段的序列進行同源性比對，通過染色體定位分析、內含子/外顯子分析、可讀框(open reading frame, ORF)分析及表達譜分析等，可以初步明確基因的編碼序列，並可對其編碼產物的基本性質，如跨膜區、信號膚序列等進行分析。由於基因數據庫的信息量不斷增大，利用有限的序列信息即可通過同源性搜索獲得全長基因序列，然後，利用美國國立生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)的 ORF Finder軟件或EMBOSS中的getorf軟件進行ORF分析，並根據編碼序列和非編碼序列的結構特點，便可確定基因的編碼序列。
2、用cDNA文庫法分析基因編碼序列 對cDNA進行克隆測序或構建cDNA文庫是最早分析基因編碼序列的方法。全長cDNA文庫一般可以通過mRNA的結構特徵進行判斷，因為儘管細胞中各mRNA的序列互不相同，但基本上都由3部分組成，即5'-UTR、編碼序列和3'-UTR,其中編碼序列含有以起始密碼子開頭、終止密碼子結尾的ORF。
以cDNA文庫作為編碼序列的模板，利用PCR法即可將目的基因的編碼序列釣取出來，如果按基因的保守序列合成PCR引物，即可從cDNA文庫中克隆未知基因的編碼序列；還可通過分析PCR產物來觀察mRNA的不同拼接方式。
cDNA末端快速擴增(rapid-amplification of cDNA end, RACE)技術（包括5'-和3'-RACE)是高效釣取未知基因編碼序列的一種方法，該方法可以利用mRNA內很短的一段序列來擴增與其互補的 cDNA末端序列，以此為線索，經過多次擴增及測序分析，最終可以獲得基因的全部編碼序列。
此外，採用核酸雜交法可從cDNA文庫中，獲得特定基因編碼序列的cDNA克隆，該方法為尋找同源編碼序列提供了可能，其做法是：根據其他生物的基因序列合成一段DNA探針，然後以核酸雜交法篩選所構建的cDNA文庫，進而對陽性克隆的cDNA片段進行序列分析，也將此方法稱為動物園雜交 (zoo hybrization) 。
3、用RNA剪接分析法確定基因編碼序列通常情況下，選擇性剪接的轉錄產物可以通過基因表達序列標籤(expression sequence tag, EST)的比較進行鑑定，但這種方法需進行大量的EST序列測 定；同時由於大多數EST文庫來源於非常有限的組織，故組織特異性剪接變異體也很可能丟失。 目前，高通量分析RNA剪接的方法主要有3種：①基於DNA芯片的分析法：常用的是代表外顯子的 DNA芯片或外顯字/外顯子交界的DNA片段芯片；②交聯免疫沉澱法：用紫外線將蛋白質和RNA交聯在一起，然後用特異性抗體將蛋白質-RNA複合物沉澱，通過分析蛋白質結合的RNA序列，便可確 定RNA的剪接位點；③體外報告基因測定法：即將報告基因克隆到載體中，使RNA剪接作為活化報告基因的促進因素，通過分析報告基因的表達水平，即可推測克隆片段的RNA剪接情況，以此為線索便可分析基因的編碼序列。

啟動子的確定主要採用生物信息學、啟動子克隆法和核酸蛋白質相互作用法

分析啟動子結構對於研究基因表達調控具有重要意義。研究啟動子結構的方法首先可利用生物信息學方法預測啟動子，其次可採用傳統的啟動子克隆法，還可以採用核酸與蛋白質相互作用的方法 進行研究。
1、用生物信息學預測啟動子 採用生物信息學方法預測啟動子結構特徵為後續的啟動子克隆 及深入研究提供理論支撐。
（1）用啟動子數據庫和啟動子預測算法定義啟動子：由於啟動子通常涉及基因的上游區域，含有調控基因適度活化或抑制的信息，因此，在定義啟動子或預測分析啟動子結構時應包括啟動子區域的3個部分：①核心啟動子(corepromoter)；②近端啟動子(proximal promoter)：含有幾個調控元件的區域，其範圍一般涉及轉錄起點(transcription start site, TSS)上游幾百個鹼基；③遠端啟動子（sital promoter): 範圍涉及TSS上游幾千個鹼基，含有增強子和沉默子等元件。
(2)預測啟動子的其他結構特徵：啟動子區域的其他結構特徵包括GC含量、CpG比率、轉錄因子結合位點、鹼基組成及核心啟動子元件等。大約70%以上哺乳類動物基因5'-區都含有CpG島，常與啟動子序列重疊或交叉覆蓋，故可用於鑑定啟動子。也可以根據始祖啟動子與mRNA轉錄本之間的相似性鑑定啟動子。
用於啟動子預測的數據庫有多個，例如，真核啟動子數據庫(eukaryotic promoter database, EPD)主要預測真核RNA聚合酶Ⅱ型啟動子，數據庫中的所有啟動子數據信息都經過實驗證實；轉錄調控區數據庫(transcription regulatory region database, TRRD)的數據來源於已發表的科學論文。這些數據庫主要通過計算機識別、判斷及分析，在數據庫中尋找啟動子的特異性特徵結構。
2、用PCR結合測序技術分析啟動子結構 該方法最為簡單和直接，即根據基因的啟動子序列，設計一對引物，然後以PCR法擴增啟動子，經測序分析啟動子序列結構。
3、用核酸-蛋白質相互作用技術分析啟動子結構 足跡法(footprinting)用於分析啟動子中潛在的調節蛋白結合位點，利用DNA電泳條帶連續性中斷的圖譜特點判斷與蛋白質結合的DNA區域，它是研究核酸-蛋白質相互作用的方法，而不是專門用於研究啟動子結構的方法，足跡法需要對被檢DNA進行切割，根據切割DNA試劑的不同，足跡法可分為酶足跡法和化學足跡法。
(1)用核酸酶進行足跡分析：酶足跡法(enzymatic footprinting)是利用DNA酶處理 DNA-蛋白質複合物，然後通過電泳分析蛋白質結合序列。常用的酶有DNA酶I(DNase I) 和核酸外切酶Ⅲ。
DNase I足跡法的基本原理：將可能含有目的啟動子序列的雙鏈DNA片段進行單鏈末端標記，然後與細胞核抽提物進行體外結合反應，進而經DNase I隨機切割，從而產生一系列長短不同的DNA片段，最後經變性聚丙烯醯胺凝膠電泳分離，形成僅相差一個核苷酸的一系列DNA條帶。由於DNA結合蛋白可保護其結合的DNA序列不受DNase I的酶切消化，從而在凝膠電泳的感光膠片上出現無條帶的空白區域，該現象類似蛋白質在DNA上留下的足跡。通過對空白區域相應的DNA進行克隆和測序，並對照未經結合反應的DNA 序列標誌，即可鑑定蛋白質結合區的DNA之精確序列。
核酸外切酶Ⅲ足跡法的基本原理類似 DNase I足跡法，即利用核酸外切酶Ⅲ的3'→5'外切酶活性，從3'-末端切割雙鏈DNA，從而確定蛋白質在DNA上的結合位點。
(2) 用化學試劑進行足跡分析：化學足跡法(chemical footprinting )是利用能切斷DNA骨架的化 學試劑處理DNA-蛋白質複合物，由於化學試劑無法接近結合了蛋白質的DNA區域，因此在電泳上形成空白區域的位置就是DNA 結合蛋白的結合位點。最常用的化學足跡法是經自由基足跡法 (hydroxyl radical footprinting )。
羥自由基足跡法利用脛自由基攻擊DNA分子表面的脫氧核糖骨架，若DNA結合蛋白將脫氧核糖遮蓋，則自由輕基無法靠近，於是便可在凝膠電泳中出現缺失條帶的現象。由於羥自由基分子量小，不受本身空間位阻的影響，相對於DNase I和核酸外切酶皿足跡法而言，羥自由基足跡法產生的足跡更小，更有利於確定蛋白質在DNA上的結合位點。
還可用電泳遷移率變動分析(electrophoretic mob山ty shift assay, EMSA)和染色質免疫沉澱(chromatin immuno-precipitation , ChIP)技術鑑定啟動子。由於EMSA和 ChIP均只能確定DNA序列中含有核蛋白結合位點，故尚需結合DNA足跡實驗和DNA測序等技術來確定具體結合序列。

轉錄起始點的確定採用生物信息學、直接克隆測序法和5'-RACE法

在原核或真核生物，RNA聚合酶通過識別和結合啟動子而在基因的轉錄起點(TSS)啟動基因的轉錄。此處主要介紹分析真核生物基因TSS的技術。
1、用數據庫搜索TSS 目前，數據庫巳成為搜索TSS的重要工具。利用對寡核苷酸帽法構建的全長cDNA文庫5'-末端測序所得的數據信息建立了一個TSS數據庫(database of transcription start sites, DBTSS), 並在此基礎上，通過將寡核苷酸帽法和大量平行測序技術相結合開發了一種TSS測序法，從而實現了一次測試可產生1×l0⁷個TSS的數據。由此可見，利用數據庫資源可以為基因TSS的鑑定提供重要參考。
2、用cDNA克隆直接測序法鑑定TSS 最早對TSS的鑑定方法就是直接對cDNA克隆進行測序分析。以mRNA為模板，經逆轉錄合成cDNA第一鏈，同時利用逆轉錄酶的末端轉移酶活性，在cDNA第一鏈的末端加上poly C尾，並以此引導合成cDNA第二鏈。將雙鏈cDNA克隆於適宜載體，通過對克隆cDNA的5'-末端進行測序分析即可確定基因的TSS序列。該方法比較簡單，尤其適於對特定基因TSS的分析。但該方法依賴於逆轉錄合成全長cDNA, 一旦cDNA的5'-末端延伸不全，或在逆轉錄之前或過程中mRNA的5'-末端出現部分降解，便可導致5'-末端部分缺失，從而影響對TSS的序列測定。
3、用5'-cDNA末端快速擴增技術鑑定TSS 5'-cDNA末端快速擴增技術(5'-rapid amplification of cDNA end, 5'-RACE)是一種基於 PCR從低豐度的基因轉錄本中快速擴增cDNAS'-末端的有效方法。以下簡要介紹一種利用高特異性5'-RACE法鑑定TSS的技術：①用鹼性磷酸酶去掉總RNA中裸露的5,-磷酸基團；②用煙草酸焦磷酸酶去掉mRNA的5'-帽子結構，保留一個磷酸基團；③用T4 RNA連接酶將5'-RACE適配體(5'-RACE adapter)連接到去帽mRNA的5'-末端；④以上述帶有5'-RACE適配體的mRNA為模板，用逆轉錄酶和隨機寡核昔酸引物進行逆轉錄合成cDNA；⑤巢式PCR反應：先用下游外側基因特異性引物(gene specific primer 1, GSPl)和5'-RACE外側引物進行外側PCR反應；然後再使用下游內側基因特異性引物(GSP2)和5'-RACE內側引物進行內側PCR反應；⑥通過對最終的PCR產物直接進行DNA測序或先進行DNA克隆後再測序，從而明確特定基因的TSS序列。
在5'-RACE的基礎上，通過在轉錄本5'-末端引入特殊的Ⅱ型限制性內切酶識別位點，可將多個5'-末端短片段串聯在一起，進而通過對串聯片段的一次測序可獲得多個基因的TSS序列信息。常用的技術包括5'-末端基因表達系列分析(5'-end serial analysis of gene expression, 5'-SAGE)和帽分析基因表達(cap analysis gene expression, CAGE)技術。

其他順式作用元件的確定

順式作用元件(cis-acting element) 指存在於基因非編碼序列中，能影響編碼基因表達的序列。 除上文所描述的順式作用元件外，增強子、沉默子、絕緣子等都可以參與基因表達調控，因發揮重要的調控作用而被廣泛關注。
增強子指能增加同它連鎖的基因轉錄效果的 DNA 序列。增強子是通過啟動子來增加轉錄的。有效的增強子可以位於基因的5'-端，也可位於基因的3'-端，有的還可位於基因的內含子中。增強子 的效應很明顯，一般能使基因轉錄效果增加10～200倍，有的甚至可以高達上千倍。例如，人珠蛋白基因的表達水平在巨細胞病毒(cytomegalovirus, CMV) 增強子作用下可提高600～1000倍。增強子的作用同增強子的方向(5'→3'或3'→5')無關，甚至遠離靶基因達幾千kb也仍有增強作用。常用於鑑定增強子的方法包括染色質免疫共沉澱技術(ChIP) 結合測序技術(ChIP-seq)和位點特異性整合熒光激活細胞分選測序技術(site-specific integration fluorescence-activated cell sorting followed by sequencing, SIF-seq)分析法。
沉默子是基因的負調控元件。真核細胞中沉默子的數量遠遠少於增強子。沉默子的 DNA 序列被調控蛋白質結合後阻斷了轉錄起始複合物的形成或活化，使基因表達活性關閉。絕緣子(insulator)是一類特殊的順式作用元件，它不同於增強子，其功能是阻止激活或阻遏作用在染色體上的傳遞，使染色質的活性限定於結構域之內。如果將一個絕緣子置於增強子和啟動子之間，它能阻止增強子對啟動子的激活。另外，如果一個絕緣子在活性基因和異染色質之間，則可以保護該基因免受異染色質化而失活。這些性質說明絕緣子可能影響染色質的組織結構。
近幾年來，利用染色質免疫共沉澱技術、染色體構象捕獲(chromosome conformation capture, 3 C) 等表觀遺傳學技術，結合芯片或新一代測序技術等高通量技術平台，以及生物信息學分析手段來鑑定這些具有調節基因表達的順式作用元件，已經成為後基因時代的研究熱點和發展趨勢。

檢測基因的拷貝數是了解基因表達豐度的重要因素

分析某種基因的種類及拷貝數，實質上就是對基因進行定性和定量分析，常用的技術包括 DNA 印跡 (Southern 印跡）、實時定量 PCR 技術等。DNA 印跡是根據探針信號出現的位置和次數判斷基因的拷貝數。一般情況下，DNA 印跡可以準確地檢測位於基因組不同位置上的相同拷貝基因，但如果基因的多個拷貝成簇地排列再基因組上，則應配合DNA測序進行分析。DNA印跡除了作為基因拷貝數的檢測方法外，還常用於基因定位、基因酶切圖譜、基因突變和基因重排等分析。實時定量PCR 是通過被擴增基因在數量上的差異推測模板基因拷貝數的異同。DNA測序是最精確的鑑定基因拷貝數的方法。

分析基因表達的產物可採用組學方法和特異性測定方法

基因表達產物包括RNA和蛋白質/多肽，因此分析基因表達可以從RNA和蛋白質/多肽水平上進行。 在1968年中心法則確立前後的數年間，只能通過測定代謝酶活性，或採用核素標記結合原位雜交、凝膠電泳、放射自顯影分析基因表達。20世紀70年代中期以後，RNA印跡(1977年）和蛋白質印跡(1979年）成為分析特異基因表達的常規技術。DNA克隆技術的誕生(1973年）推動了基因組DNA和cDNA的分離與鑑定；1980—1990年間，積累了大量EST;1990年代初，各種DNA、EST、mRNA數據庫應運而生。隨後，PCR (1986年），特別是實時定量PCR與數據庫檢索相結合，通過合成特異引物檢測基因表達幾乎取代了先前的RNA印跡。隨着人類基因組測序的完成，為了滿足基因功能詮釋和從「 組學」水平揭示基因表達譜的需要，各種生物芯片（包括核酸和蛋白質芯片）技術應運而生，結合20世紀80～90年代建立的轉基因、基因敲除/敲入技術，基因表達及功能分析技術日趨成熟。

通過檢測RNA在轉錄水平分析基因表達

根據分析方法的原理和功能特性，可將基因轉錄水平分析分為封閉和開放性系統研究方法。封閉性系統研究方法（如DNA芯片、RNA印跡、實時RT-PCR等）的應用範圍僅限於已知基因。開放性系統研究方法（如差異顯示PCR、雙向基因表達指紋圖譜、分子索引法、隨機引物 PCR 指紋分析等）可用於發現和分析未知基因。此處主要介紹常用的針對已知基因的轉錄水平分析技術。
1、用核酸雜交法檢測RNA表達水平 核酸分子雜交法是目前生物化學及分子生物學研究領域應用非常廣泛的技術之一，是定性或者定量特異性檢測RNA序列片段的有效工具。
(1)用RNA印跡分析RNA表達：RNA印跡，也稱Northern印跡，被廣泛應用於RNA表達分析，並作為鑑定RNA轉錄本、分析其大小的標準方法。儘管RNA印跡並不適合高通量分析，但對於那些通過差異顯示RT-PCR或DNA芯片等技術獲得的差異表達的RNA，可用RNA印跡來確證；對於新發現的cDNA序列，以其為探針對組織或細胞的RNA樣品進行RNA印跡分析，可確定與之互補的RNA真實存在。
(2)用核糖核酸酶保護實驗分析RNA水平及其剪接情況：RNA酶保護實驗(ribonuclease protection assay , RPA)是一種基於雜交原理分析RNA的方法，既可進行定量分析，又可研究其結構特徵。RPA的原理如下：用含特定DNA序列的質粒為模板，經體外轉錄，製備RNA探針；將標記的RNA探針與樣品RNA雜交後，經只水解單鏈RNA的RNA酶處理，即可去除游離探針及雙鏈RNA中 的單鏈區域，而使雜交雙鏈RNA受到保護不被消化。回收雜交雙鏈並進行變性聚丙烯醯胺凝膠電泳後，通過檢測探針標記物便可 顯示對應於探針大小的RNA片段。
RPA技術可對RNA分子的末端以及外顯子/內含子的交界進行定位，確定轉錄後RNA的剪接途徑。 此外，RPA還可用於特定RNA的豐度分析。與RNA印跡相比，RPA的靈敏度和分析效率更高，該方法可在一次實驗中同時分析幾種mRNA，但因每一個探針的實驗條件需認真優化，因此這一方法不適於高通量分析。
(3)用原位雜交進行RNA區域定位：原位雜交(in situ hybridization, ISH)是通過設計與目標RNA 鹼基序列互補的寡核苷酸探針，利用雜交原理在組織原位檢測RNA的技術，其可對細胞或組織中原位表達的RNA進行區域定位，同時也可作為定量分析的補充。
2、用PCR技術檢測RNA表達水平 PCR 技術是目前生物化學與分子生物學 領域應用最為便捷、廣泛的技術，可快速對RNA分子進行定量或者定性檢測。
(1)用逆轉錄PCR進行RNA的半定量分析：RT-PCR一般用於RNA的定性分析；如果設置陽性參照，則可對待測RNA樣品進行半定量分析（即對基因的相對表達水平進行比較）。
(2)用實時定量PCR進行RNA的定量分析：實時定量PCR是定量分析RNA的最通用、最快速、最簡便的方法，該方法是對PCR反應進行實時監測，具有很高的靈敏度和特異性。
3、用基因芯片和高通量測序技術分析RNA表達水平 基因芯片和高通量測序技術的應用大大加速了揭示基因組、轉錄組結構與功能的步伐，是目前宏觀分析RNA表達的有效技術手段。
(1) 基因芯片已成為基因表達譜分析的常用方法：目前，基因芯片技術巳廣泛應用於基因表達譜分析，主要採用cDNA芯片，其便於對不同狀態（如生理和病理條件）下的基因表達譜進行比較，揭示轉錄組差異表達的規律，對探索發病機制、評價治療效果、篩選藥物靶標具有重要意義。
(2)用循環芯片測序技術分析基因表達譜：運用循環芯片測序技術，可對基因表達譜進行高通最分析，一次可完成幾十萬到幾百萬個DNA分子片段的序列測定，從而快速獲得轉錄組或基因組的全貌。除用於DNA測序外，循環芯片測序技術還廣泛應用於基因組分析的各個方面：在DNA水平上，可以大規模地分析基因組甲基化、篩選突變基因、檢測基因多態性；在RNA水平上，可以對RNA片段進行掃描、定量與鑑定，對全基因組進行廣譜表達研究等。循環芯片測序技術的另一個廣泛應用領域是小分子RNA或非編碼RNA的研究。

通過檢測蛋白質/多肽而在翻譯水平分析基因表達

蛋白質/多肽是結構基因表達的最終產物，其質和量的變化直接反映了基因的功能。以下簡要介紹幾種檢測蛋白質/多肽的技術。
1、用蛋白質印跡技術檢測蛋白質/多肽 該技術需要將蛋白質/多肽轉移到固相支待物上進行檢測。
2、用酶聯免疫吸附實驗分析蛋白質/多肽 與蛋白質印跡相似，酶聯免疫吸附實驗(ELISA)也是一種建立在抗原-抗體反應基礎上的蛋白質/多肽分析方法，其主要用於測定可溶性抗原或抗體，該方法需要將已知抗原或抗體吸附於固相載體（如聚苯乙烯微量反應板）表面，使抗原-抗體反應在固相表面進行。常用的 ELISA 方法包括雙抗體夾心法、間接法、酶聯免疫斑點實驗(ELISPOT)以及生物素-親和素系統-ELISA (biotin avidin system ELISA, BAS-ELISA)。
3、用免疫組化實驗原位檢測組織/細胞表達的蛋白質/多肽 包括免疫組織化學 (immunohistochemistry) 和免疫細胞化學(immunocytochemistry) 實驗，兩者原理相同，都是用標記的抗體在組織/細胞原位對目標抗原（目標蛋白質/多肽）進行定性、定量、定位檢測。 常用技術包括酶免疫組化（酶標記）、免疫熒光組化（熒光標記，可用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡進行觀察）、免疫金組化（膠體金顆粒標記）、免疫電鏡技術（鐵蛋白、膠體金或過氧化物酶標記）等。
4、用流式細胞術分析表達特異蛋白質的陽性細胞 流式細胞術(flow cytometry)通常利用熒光標記抗體與抗原的特異性結合，經流式細胞儀分析熒光信號，從而根據細胞表達特定蛋白質的水平對某種蛋白質陽性細胞（即特異基因表達的細胞）作出判斷。流式細胞術既可檢測活細胞，也可檢測用甲醒固定的細胞，被廣泛用於細胞表面和細胞內分子表達水平的定量分析，並能根據各種蛋白質的表達模式區分細胞亞群。此外，流式細胞術可使用多種熒光標記的抗體同時對多個基因產物進行標記和監測，是對細胞進行快速分析、分選、特徵鑑定的一種有效方法。
5、用蛋白質芯片分析蛋白質/多肽表達水平 用蛋白質芯片分析蛋白質/多肽的表達譜：運用蛋白質芯片可高通量分析蛋白質/多肽的表達和功能。根據製作方法和用途不同，可將其分為蛋白質檢測和功能芯片兩大類。蛋白質檢測芯片包括抗體芯片、抗原芯片、配體芯片等，它是將具有高親和力的特異性探針分子（如單克隆抗體）固定在基片上，用以識別生物樣品溶液中的目標多肽；蛋白質功能芯片可用來研究蛋白質修飾、蛋白質-蛋白質/蛋白質-DNA/蛋白質-RNA,以及蛋白質與脂質、蛋白質與藥物、酶與底物、蛋白質-小分子等的相互作用。
與基因芯片類似，蛋白質芯片可用於檢測組織/細胞來源的樣品中蛋白質的表達譜；其精確程度、信息範疇取決於芯片上已知多膚的信息多寡。由於多肽合成昂貴，蛋白質來源受限，加之蛋白質操作技術難，使蛋白質芯片的應用受到限制。
6、雙向電泳高通量分析蛋白質表達譜 用雙向電泳分析蛋白質/多肽表達譜：雙向電泳可同時分離成百上千的蛋白質。電泳結果經染色後，既可對不同樣品中蛋白質的表達譜進行比較；還可以從凝膠中將特定的蛋白質點切下，經胰蛋白酶消化後得到短肽片段，利用質譜技術進行定性分析，對差異表達的蛋白質進行鑑定。