生物化學與分子生物學/PCR實驗技術/qRT-PCR操作步驟

樣品RNA的抽提

①解凍細胞

取凍存已裂解的細胞，室溫放置5分鐘使其完全溶解。

②兩相分離

每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的氯仿，蓋緊管蓋。手動劇烈振盪管體15秒後，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心後混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配於水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。

③RNA沉澱

將水相上層轉移到一乾淨無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉澱其中的RNA，混勻後15到30℃孵育10分鐘後，於4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉澱將在管底部和側壁上形成膠狀沉澱塊。

④RNA清洗

移去上清液，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配製），清洗RNA沉澱。混勻後，4℃下7000rpm離心5分鐘。

⑤RNA乾燥

小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉澱在室溫空氣中乾燥5-10分鐘。

⑥溶解RNA沉澱

溶解RNA時，先加入無RNA酶的水40μl用槍反覆吹打幾次，使其完全溶解，獲得的RNA溶液保存於-80℃待用。

RNA質量檢測

紫外吸收法測定

先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調零。然後取少量RNA溶液用TE稀釋（1:100）後，讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，測定RNA溶液 濃度和純度。

① 濃度測定

A260下讀值為1表示40 µg RNA/ml。樣品RNA濃度(µg/ml)計算公式為：A260 ×稀釋倍數× 40 µg/ml。具體計算如下：

RNA溶於40 µl DEPC水中，取5ul，1:100稀釋至495µl的TE中，測得A260 = 0.21

RNA 濃度= 0.21 ×100 ×40 µg/ml = 840 µg/ml 或 0.84 µg/µl

取5ul用來測量以後，剩餘樣品RNA為35 µl，剩餘RNA總量為：35 µl × 0.84 µg/µl = 29.4 µg

②純度檢測

RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度，比值範圍1.8到2.1。

變性瓊脂糖凝膠電泳測定

①制膠

1g瓊脂糖溶於72ml水中，冷卻至60℃，10 ml的10× MOPS電泳緩衝液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。

10×MOPS電泳緩衝液

濃度	成分
0.4M	MOPS，pH 7.0
0.1M	乙酸鈉
0.01M	EDTA

灌制凝膠板，預留加樣孔至少可以加入25 µl溶液。膠凝後取下梳子，將凝膠板放入電泳槽內，加足量的1×MOPS電泳緩衝液至覆蓋膠面幾個毫米。

②準備RNA樣品

取3µgRNA，加3倍體積的甲醛上樣染液，加EB於甲醛上樣染液中至終濃度為10µg/ml。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。

③電泳

上樣前凝膠須預電泳5min，隨後將樣品加入上樣孔。5–6V/cm電壓下2h，電泳至溴酚蘭指示劑進膠至少2–3cm。

④紫外透射光下觀察並拍照

28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃（其大小決定於用於抽提RNA的物種類型），上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀察到一個更小稍微擴散的帶，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖體RNA）組成。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質，可能是由mRNA和其它異型RNA組成。RNA製備過程中如果出現DNA污染，將會在28S核糖體RNA帶的上面出現，即更高分子量的彌散遷移物質或者帶，RNA的降解表現為核糖體RNA帶的彌散。用數碼照相機拍下電泳結果。

樣品cDNA合成

①反應體系

反應體系

序號	反應物	劑量
1	逆轉錄buffer	2μl
2	上游引物	0.2μl
3	下游引物	0.2μl
4	dNTP	0.1μl
5	逆轉錄酶MMLV	0.5μl
6	DEPC水	5μl
7	RNA模版	2μl
8	總體積	10μl

序號  反應物  劑量

1  逆轉錄buffer 

2  上游引物 

3  下游引物 

4  dNTP 

5    0.5μl

6    5μl

7    2μl

8  總體積  10μl

輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

②混合液在加入逆轉錄酶MMLV 之前先70℃干浴3分鐘，取出後立即冰水浴至管內外溫度一致，然後加逆轉錄酶0.5μl，37℃水浴60分鐘。

③取出後立即95℃干浴3分鐘，得到逆轉錄終溶液即為cDNA溶液，保存於-80℃待用。

梯度稀釋的標準品及待測樣品的管家基因（β-actin）實時定量PCR

• ①β-actin陽性模板的標準梯度製備：陽性模板的濃度為1011，反應前取3μl按10倍稀釋（加水27μl並充分混勻）為10¹⁰，依次稀釋至10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴，以備用。

• ②反應體系如下：

標準品反應體系

序號	反應物	劑量
1	SYBR Green 1 染料	10μl
2	陽性模板上游引物F	0.5μl
3	陽性模板下游引物R	0.5μl
4	dNTP	0.5μl
5	Taq酶	1μl
6	陽性模板DNA	5μl
7	ddH2O	32.5μl
8	總體積	50μl

輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

管家基因反應體系：

序號	反應物	劑量
1	SYBR Green 1 染料	10μl
2	內參照上游引物F	0.5μl
3	內參照下游引物R	0.5μl
4	dNTP	0.5μl
5	Taq酶	1μl
6	待測樣品cDNA	5μl
7	ddH2O	32.5μl
8	總體積	50μl

輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

• ③製備好的陽性標準品和檢測樣本同時上機，反應條件為：93℃　2分鐘，然後93℃ 1分鐘，55℃ 2分鐘，共40個循環。

5 製備用於繪製梯度稀釋標準曲線的DNA模板

• ①針對每一需要測量的基因，選擇一確定表達該基因的cDNA模板進行PCR反應。

反應體系：

序號	反應物	劑量
1	10× PCR緩衝液	2.5ul
2	MgCl2 溶液	1.5ul
3	上游引物F	0.5ul
4	下游引物R	0.5ul
5	dNTP混合液	3ul
6	Taq聚合酶	1ul
7	cDNA	1ul
8	加水至總體積為	25ul

輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

35個PCR循環（94℃1分鐘；55℃1分鐘；72℃1分鐘）； 72ºC延伸5分鐘。

• ②PCR產物與 DNA Ladder在2％瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色，檢測PCR產物是否為單一特異性擴增條帶。

• ③將PCR產物進行10倍梯度稀釋: 將PCR產物進行10倍梯度稀釋: 設定PCR產物濃度為1×10¹⁰，依次稀釋至10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴幾個濃度梯度。

6 待測樣品的待測基因實時定量PCR

• ①所有cDNA樣品分別配置實時定量 PCR反應體系。

體系配置如下：

序號	反應物	劑量
1	SYBR Green 1 染料	10 ul
2	上游引物	1ul
3	下游引物	1ul
4	dNTP	1ul
5	Taq聚合酶	2ul
6	待測樣品cDNA	5ul
7	ddH2O	30ul
8	總體積	50ul

輕彈管底將溶液混合，6000rpm短暫離心。

• ②將配製好的PCR反應溶液置於Realtime PCR儀上進行PCR擴增反應。反應條件為：93℃2分鐘預變性，然後按93℃ 1分鐘，55℃1分鐘，72℃1分鐘，共40做個循環，最後72℃7分鐘延伸。

實時定量PCR使用引物列表

引物設計軟件：Primer Premier 5.0，並遵循以下原則：引物與模板的序列緊密互補；引物與引物之間避免形成穩定的二聚體或髮夾結構；引物不在模板的非目的位點引發DNA 聚合反應(即錯配)。

電泳

各樣品的目的基因和管家基因分別進行Realtime PCR反應。PCR產物與 DNA Ladder在2％瓊脂糖凝膠電泳，GoldView™染色，檢測PCR產物是否為單一特異性擴增條帶。