生物化學與分子生物學/PCR實驗技術/qRT-PCR操作步驟

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樣品RNA的抽提[編輯]

①解凍細胞[編輯]

取凍存已裂解的細胞,室溫放置5分鐘使其完全溶解。

②兩相分離[編輯]

每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的氯仿,蓋緊管蓋。手動劇烈振盪管體15秒後,15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘。離心後混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相,中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配於水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。

③RNA沉澱[編輯]

將水相上層轉移到一乾淨無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉澱其中的RNA,混勻後15到30℃孵育10分鐘後,於4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉澱將在管底部和側壁上形成膠狀沉澱塊。

④RNA清洗[編輯]

移去上清液,每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配製),清洗RNA沉澱。混勻後,4℃下7000rpm離心5分鐘。

⑤RNA乾燥[編輯]

小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉澱在室溫空氣中乾燥5-10分鐘。

⑥溶解RNA沉澱[編輯]

溶解RNA時,先加入無RNA酶的水40μl用槍反覆吹打幾次,使其完全溶解,獲得的RNA溶液保存於-80℃待用。

RNA質量檢測[編輯]

紫外吸收法測定[編輯]

先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調零。然後取少量RNA溶液用TE稀釋(1:100)後,讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值,測定RNA溶液 濃度和純度。

① 濃度測定[編輯]

A260下讀值為1表示40 µg RNA/ml。樣品RNA濃度(µg/ml)計算公式為:A260 ×稀釋倍數× 40 µg/ml。具體計算如下:

RNA溶於40 µl DEPC水中,取5ul,1:100稀釋至495µl的TE中,測得A260 = 0.21

RNA 濃度= 0.21 ×100 ×40 µg/ml = 840 µg/ml 或 0.84 µg/µl

取5ul用來測量以後,剩餘樣品RNA為35 µl,剩餘RNA總量為:35 µl × 0.84 µg/µl = 29.4 µg

②純度檢測[編輯]

RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度,比值範圍1.8到2.1。

變性瓊脂糖凝膠電泳測定[編輯]

①制膠[編輯]

1g瓊脂糖溶於72ml水中,冷卻至60℃,10 ml的10× MOPS電泳緩衝液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。

10×MOPS電泳緩衝液
濃度 成分
0.4M MOPS,pH 7.0
0.1M 乙酸鈉
0.01M EDTA

灌制凝膠板,預留加樣孔至少可以加入25 µl溶液。膠凝後取下梳子,將凝膠板放入電泳槽內,加足量的1×MOPS電泳緩衝液至覆蓋膠面幾個毫米。

②準備RNA樣品[編輯]

取3µgRNA,加3倍體積的甲醛上樣染液,加EB於甲醛上樣染液中至終濃度為10µg/ml。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。

③電泳[編輯]

上樣前凝膠須預電泳5min,隨後將樣品加入上樣孔。5–6V/cm電壓下2h,電泳至溴酚蘭指示劑進膠至少2–3cm。

④紫外透射光下觀察並拍照[編輯]

28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃(其大小決定於用於抽提RNA的物種類型),上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀察到一個更小稍微擴散的帶,它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖體RNA)組成。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質,可能是由mRNA和其它異型RNA組成。RNA製備過程中如果出現DNA污染,將會在28S核糖體RNA帶的上面出現,即更高分子量的彌散遷移物質或者帶,RNA的降解表現為核糖體RNA帶的彌散。用數碼照相機拍下電泳結果。

樣品cDNA合成[編輯]

①反應體系[編輯]

反應體系
序號 反應物 劑量
1 逆轉錄buffer  2μl
2 上游引物 0.2μl
3 下游引物 0.2μl
4 dNTP 0.1μl
5 逆轉錄酶MMLV 0.5μl
6 DEPC水 5μl
7 RNA模版 2μl
8 總體積 10μl


序號  反應物  劑量

1  逆轉錄buffer 

2  上游引物 

3  下游引物 

4  dNTP 

5    0.5μl

6    5μl

7    2μl

8  總體積  10μl

輕彈管底將溶液混合,6000rpm短暫離心。

②混合液在加入逆轉錄酶MMLV 之前先70℃干浴3分鐘,取出後立即冰水浴至管內外溫度一致,然後加逆轉錄酶0.5μl,37℃水浴60分鐘。

③取出後立即95℃干浴3分鐘,得到逆轉錄終溶液即為cDNA溶液,保存於-80℃待用。

梯度稀釋的標準品及待測樣品的管家基因(β-actin)實時定量PCR[編輯]

  • ①β-actin陽性模板的標準梯度製備:陽性模板的濃度為1011,反應前取3μl按10倍稀釋(加水27μl並充分混勻)為1010,依次稀釋至109、108、107、106、105、104,以備用。
  • ②反應體系如下:
標準品反應體系
序號 反應物 劑量
1 SYBR Green 1 染料 10μl
2 陽性模板上游引物F 0.5μl
3 陽性模板下游引物R 0.5μl
4 dNTP 0.5μl
5 Taq酶 1μl
6 陽性模板DNA 5μl
7 ddH2O 32.5μl
8 總體積 50μl

輕彈管底將溶液混合,6000rpm短暫離心。

管家基因反應體系:
序號 反應物 劑量
1 SYBR Green 1 染料 10μl
2 內參照上游引物F 0.5μl
3 內參照下游引物R 0.5μl
4 dNTP 0.5μl
5 Taq酶 1μl
6 待測樣品cDNA 5μl
7 ddH2O 32.5μl
8 總體積 50μl

輕彈管底將溶液混合,6000rpm短暫離心。

  • ③製備好的陽性標準品和檢測樣本同時上機,反應條件為:93℃ 2分鐘,然後93℃ 1分鐘,55℃ 2分鐘,共40個循環。

5 製備用於繪製梯度稀釋標準曲線的DNA模板[編輯]

  • ①針對每一需要測量的基因,選擇一確定表達該基因的cDNA模板進行PCR反應。
反應體系:
序號 反應物 劑量
1 10× PCR緩衝液 2.5ul
2 MgCl2 溶液 1.5ul
3 上游引物F 0.5ul
4 下游引物R 0.5ul
5 dNTP混合液 3ul
6 Taq聚合酶 1ul
7 cDNA 1ul
8 加水至總體積為 25ul

輕彈管底將溶液混合,6000rpm短暫離心。

35個PCR循環(94℃1分鐘;55℃1分鐘;72℃1分鐘); 72ºC延伸5分鐘。

  • ②PCR產物與 DNA Ladder在2%瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠染色,檢測PCR產物是否為單一特異性擴增條帶。
  • ③將PCR產物進行10倍梯度稀釋: 將PCR產物進行10倍梯度稀釋: 設定PCR產物濃度為1×1010,依次稀釋至109、108、107、106、105、104幾個濃度梯度。

6 待測樣品的待測基因實時定量PCR[編輯]

  • ①所有cDNA樣品分別配置實時定量 PCR反應體系。
體系配置如下:
序號 反應物 劑量
1 SYBR Green 1 染料 10 ul
2 上游引物 1ul
3 下游引物 1ul
4 dNTP 1ul
5 Taq聚合酶 2ul
6 待測樣品cDNA 5ul
7 ddH2O 30ul
8 總體積 50ul

輕彈管底將溶液混合,6000rpm短暫離心。

  • ②將配製好的PCR反應溶液置於Realtime PCR儀上進行PCR擴增反應。反應條件為:93℃2分鐘預變性,然後按93℃ 1分鐘,55℃1分鐘,72℃1分鐘,共40做個循環,最後72℃7分鐘延伸。

實時定量PCR使用引物列表[編輯]

引物設計軟件:Primer Premier 5.0,並遵循以下原則:引物與模板的序列緊密互補;引物與引物之間避免形成穩定的二聚體或髮夾結構;引物不在模板的非目的位點引發DNA 聚合反應(即錯配)。

電泳[編輯]

各樣品的目的基因和管家基因分別進行Realtime PCR反應。PCR產物與 DNA Ladder在2%瓊脂糖凝膠電泳,GoldView™染色,檢測PCR產物是否為單一特異性擴增條帶。