生物化學與分子生物學/其他實驗技術/免疫共沉澱Co-IP實驗操作步驟

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原理[編輯]

免疫共沉澱(Co-Immunoprecipitation)是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用於研究蛋白質相互作用的經典方法。是確定兩種蛋白質在完整細胞內生理性相互作用的有效方法。其原理是:當細胞在非變性條件下被裂解時,完整細胞內存在的許多蛋白質-蛋白質間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質X的抗體免疫沉澱X,那麼與X在體內結合的蛋白質Y也能沉澱下來。目前多用精製的prorein A預先結合固化在argarose的beads上,使之與含有抗原的溶液及抗體反應後,beads上的prorein A就能吸附抗原達到精製的目的。這種方法常用於測定兩種目標蛋白質是否在體內結合;也可用於確定一種特定蛋白質的新的作用搭檔。

其優點為:

  1. 相互作用的蛋白質都是經翻譯後修飾的,處於天然狀態;
  2. 蛋白的相互作用是在自然狀態下進行的,可以避免人為的影響;
  3. 可以分離得到天然狀態的相互作用蛋白複合物。

缺點為:

  1. 可能檢測不到低親和力和瞬間的蛋白質-蛋白質相互作用;
  2. 兩種蛋白質的結合可能不是直接結合,而可能有第三者在中間起橋樑作用;
  3. 必須在實驗前預測目的蛋白是什麼,以選擇最後檢測的抗體,所以,若預測不正確,實驗就得不到結果,方法本身具有冒險性。

準備工作[編輯]

預冷PBS,RIPA Buffer,細胞刮子(用保鮮膜包好後,埋冰下),離心機

  1. 用預冷的PBS洗滌細胞兩次,最後一次吸乾PBS;
  2. 加入預冷的RIPA Buffer(1ml/107個細胞、10cm培養皿或150cm2培養瓶,0.5ml/5×106個細胞、6cm培養皿、75cm2培養瓶)
  3. 用預冷的細胞刮子將細胞從培養皿或培養瓶上刮下,把懸液轉到1.5EP管中,4℃,緩慢晃動15min(EP管插冰上,置水平搖床上)
  4. 4℃,14000g離心15min,立即將上清轉移到一個新的離心管中
  5. 準備Protein A agarose,用PBS 洗兩遍珠子,然後用PBS配製成50%濃度,建議減掉槍尖部分,避免在涉及瓊脂糖珠的操作中破壞瓊脂糖珠
  6. 每1ml總蛋白中加入100μl Protein A瓊脂糖珠(50%),4℃搖晃10min(EP管插冰上,置水平搖床上),以去除非特異性雜蛋白,降低背景
  7. 4℃,14000g離心15min,將上清轉移到一個新的離心管中,去除Protein A珠子
  8. (Bradford 法)做蛋白標準曲線,測定蛋白濃度,測前將總蛋白至少稀釋1:10倍以上,以減少細胞裂解液中去垢劑的影響(定量,分裝後,可以在-20℃保存一個月)
  9. 用PBS將總蛋白稀釋到約1 μg/μl,以降低裂解液中去垢劑的濃度,如果興趣蛋白在細胞中含量較低,則總蛋白濃度應該稍高(如10 μg/μl)
  10. 加入一定體積的兔抗到500μl總蛋白中,抗體的稀釋比例因興趣蛋白在不同細胞系中的多少而異
  11. 4℃緩慢搖動抗原抗體混合物過夜或室溫2h,激酶或磷酸酯酶活性分析建議用2 h室溫孵育
  12. 加入100μl Protein A瓊脂糖珠來捕捉抗原抗體複合物,4℃緩慢搖動抗原抗體混合物過夜或室溫1h,如果所用抗體為鼠抗或雞抗,建議加2 μl"過渡抗體"(兔抗鼠IgG,兔抗雞IgG)
  13. 14000rpm瞬時離心5s,收集瓊脂糖珠-抗原抗體複合物,去上清,用預冷的RIPA buffer洗3遍,800μl/遍,RIPA buffer有時候會破壞瓊脂糖珠-抗原抗體複合物內部的結合,可以使用PBS
  14. 用60μl 2×上樣緩衝液將瓊脂糖珠-抗原抗體複合物懸起,輕輕混勻,緩衝液的量依據上樣多少的需要而定(60 μl足夠上三道)
  15. 將上樣樣品煮5min,以游離抗原,抗體,珠子,離心,將上清電泳,收集剩餘瓊脂糖珠,上清也可以暫時凍-20℃,留待以後電泳,電泳前應再次煮5min變性。

RIPA Buffer配製:[編輯]

基礎成分:

Tris-HCl(緩衝液成分,防止蛋白變性)

NaCl(鹽份,防止非特異蛋白聚集)

NP-40(非離子去污劑,提取蛋白;用H2O配製成10%儲存液)

去氧膽酸鈉(離子去污劑,提取蛋白;用H2O配製成10%儲存液;避光保存)

注意:準備激酶(致活酶)實驗時,不要加去氧膽酸鈉,因為離子型去污劑能夠使酶變性,導致活性喪失。

RIPA蛋白酶抑制劑[編輯]

苯甲基磺醯氟(PMSF)(用異丙醇配製成200mM的儲存液,室溫保存)

EDTA(鈣螯合劑;用H2O配製成100mM的儲存液,PH 7.4)

亮抑酶肽(Leupeptin)(用H2O配製成1mg/ml的儲存液,分裝,-20℃保存)

抑蛋白酶肽(Aprotinin)(用H2O配製成1mg/ml的儲存液,分裝,-20℃保存)

胃蛋白酶抑制劑(Pepstatin)(用甲醇配製成1mg/ml的儲存液,分裝,-20℃保存)

RIPA磷酸(酯)酶抑制劑

激活的Na3VO4(用H2O配製成200mM的儲存液,見Sodium Orthovanadate Activation Protoco)

NaF(200mM的儲存液,室溫保存)