生物化學與分子生物學/其他實驗技術/大腸桿菌感受態細胞製備實驗

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細胞經過一些特殊方法(電擊法、CaCl2法)等處理後,細胞膜的通透性發生了暫時性的改變,成為能允許外源DNA分子進入的細胞,即感受態細胞(Compenent cells)。

實驗方法原理[編輯]

帶有外源DNA 的重組質體,在體外構建後,導入宿主細胞,隨着細胞的大量複製、繁殖,才能夠有機會獲得純的重組質體DNA,該過程稱之為轉化過程。受體細胞經過一些特殊方法(如:CaCl2,RuCl 等化學試劑)的處理後,細胞膜的通透性發生變化,能容許外源DNA 的載體分子通過。

實驗材料、試劑、儀器耗材:[編輯]

E. coli DH5α菌株

LB固體培養基、LB液體培養基、CaCl2、硫酸鎂、SOB、TFB等

培養皿、恆溫搖床、聚丙烯管、電熱恆溫培養箱、台式高速離心機、無菌工作枱、燒瓶、恆溫水浴鍋、低溫冰箱、製冰機、分光光度計、微量移液槍、錐形瓶、試管等

實驗步驟[編輯]

  1. 從37℃培養16-20 h的平板中挑取一個單菌落(直徑2-3 mm),轉到一個含有100 ml LB或SOB培養基的1L燒瓶中。於37℃劇烈振搖培養3 h。一般經驗,1 OD600約含有大腸桿菌DH5α 109 個/mL。
  2. 將細菌轉移到一個無菌、一次性使用的、用冰預冷的50 ml聚丙烯管中,在冰上放置10 min,使培養物冷卻至0℃。
  3. 於4℃用Sorvall GS3特頭(或與之相當的轉頭)以4 100 r/min離心10 min,以回收細胞。
  4. 倒出培養液,將管倒置1 min以使最後的痕量培養液流盡。
  5. 每50 ml初始培養液用30 ml預冷的0.1 mol/LCaCl2-MgCl2溶液(80 mmol/L MgCl2,20 mmol/L CaCl2)重懸每份細胞沉澱。
  6. 於4 ℃用Sorvall GS3轉頭(或與之相當的轉頭)以41 00 r/min離心10 min,以回收細胞。
  7. 倒出培養液,將管倒置1 min以使最後的痕量培養液流盡。
  8. 每50 ml初始培養物用2 ml用冰預冷的0.1 mol/L CaCl2(或TFB)重懸每份細胞沉澱。
  9. 此時,可以用新鮮製備的感受態細胞直接做轉化實驗,也可以將細胞凍存於- 70℃。

注意事項:[編輯]

  1. 為達到高效轉化,活細胞數務必少於10 8個細胞/mL,對於大多散大腦桿菌來說,這相當於OD值為0.4左右。為保證細菌培養物的生長密度不致過高,可每隔15-20 min測定OD600值來監測,用監測的時間及OD值列一個圖表,以便預測培養物的OD600值到0.4的時間,當OD600值達到0.35時,收穫細菌培養物。
  2. 在菌株與菌株之間,OD值與每毫升中活細胞散間的關係變化很大,因此有必要通過漶量特定腦桿菌的生長培養物在生長周期的不同時相的OD600值,並將各稀釋維度的培養物鋪於無抗生素的LB瓊脂板以計算每一時相的活細胞散,從而使分光光度計讀數得到標準化。
  3. 對大多數大腸桿菌(MC106除外),採用TFB代替CaCl2可得到相同或更好的結果。Dagert和Ehrlieh的實驗(1979)曾表明,細胞可以於4℃在CaCl2溶液中保存24-48 h,在貯存的最初12-24 h內,轉化率增加4-6倍,然後降低到初始水平。
  4. 克隆的新鮮程度,一定要選新鮮平板的單克隆,即剛塗布生長過夜的平板。
  5. 菌體的OD600值,JM109或BL21,OD值為0.35,DH5α 為0.4,要儘量保證OD值不要過高,更不能超過0.6。
  6. 低溫處理的時間,做完後冰上保存12-24 h後分裝,並保存於-80℃。
  7. 試劑和用品,所有的用品(離心管、藥瓶等)用新的,如果使用舊的,要確保乾淨,CaCl2溶液。