生物化學與分子生物學/原核基因表達調控

基因表達調控 - 基因表達調控的基本概念與特點 - 原核基因表達調控 - 真核基因表達調控
原核生物基因組是具有超螺旋結構的閉合環狀DNA分子，在結構上有以下特點：①基因組中很少有重複序列；②編碼蛋白質的結構基因為連續編碼，且多為單拷貝基因，但編碼rRNA的基因仍然是多拷貝基因；③結構基因在基因組中所佔的比例（約佔50%)遠遠大於真核基因組；④許多結構基因在基因組中以操縱子為單位排列。此外，原核生物的細胞結構也比較簡單，其基因組的轉錄和翻譯可以在同一空間內完成，並且時間上的差異不大。在轉錄過程終止之前mRNA就已經結合在核糖體上，開始了蛋白質的生物合成。

操縱子是原核基因轉錄調控的基本單位

大腸桿菌的RNA聚合酶由σ亞基（或稱σ因子）和核心酶構成，其中σ亞基的作用是識別和結合在DNA模板上的啟動序列，啟動轉錄過程。原核生物在轉錄水平的調控主要取決於轉錄起始速度，即主要調節的是轉錄起始複合物形成的速度。
原核生物大多數基因表達調控是通過操縱子機制實現的。操縱子由結構基因、調控序列和調節基因組成。
結構基因通常包括數個功能上有關聯的基因，它們串聯排列，共同構成編碼區。這些結構基因共用一個啟動子和一個轉錄終止信號序列，因此轉錄合成時僅產生一條mRNA長鏈，為幾種不同的蛋白質編碼。這樣的 mRNA 分子攜帶了幾條多肽鏈的編碼信息，被稱為多順反子(polycistron) mRNA。
調控序列主要包括啟動子和操縱元件(operator) 。啟動子是 RNA 聚合酶結合的部位，是決定基 因表達效率的關鍵元件。各種原核基因啟動序列特定區域內，通常在轉錄起始點上游-10及-35區域存在一些相似序列，稱為共有序列。E.coli 及一些細菌啟動序列的共有序列在-10區域是TATAAT，又稱Pribnow盒，在-35區域為TTGACA。這些共有序列中的任一鹼基突變或變異都會影響 RNA 聚合酶與啟動子的結合及轉錄起始。因此，共有序列決定啟動子的轉錄活性大小。操縱元件並非結構基因，而是一段能被特異的阻遏蛋白識別和結合的 DNA 序列。操縱序列與啟動序列毗鄰或接近，其 DNA 序列常與啟動子交錯、重疊，它是原核阻遏蛋白(repressor) 的結合位點。 當操縱序列結合有阻遏蛋白時會阻礙 RNA 聚合酶與啟動子的結合，或使 RNA 聚合酶不能沿 DNA 向前移動，阻遏轉錄，介導負性調節。原核操縱子調控序列中還有一種特異的 DNA 序列可結合激活蛋白（activator），結合後RNA聚合酶活性增強，使轉錄激活，介導正性調節。
調節基因(regulatory gene) 編碼能夠與操縱元件結合的阻遏蛋白。阻遏蛋白可以識別、結合特異的操縱元件，抑制基因轉錄，所以阻遏蛋白介導負性調節(negative regulation) 。阻遏蛋白介導的負性調節機制在原核生物中普遍存在。
此外，還有一些調控蛋白質對原核基因轉錄調控起着重要的作用，如特異因子和激活蛋白。這些調控蛋白質的作用分別是：①特異因子決定 RNA 聚合酶對一個或一套啟動序列的特異性識別和結合個或能力。②激活蛋白可結合啟動子鄰近的 DNA 序列，提高 RNA 聚合酶與啟動序列的結合能力，從而增強RNA聚合酶的轉錄活性，是一種正性調節(positive regulation)。分解（代謝）物基因激活蛋白(catabolite gene activator protein, CAP) 就是一種典型的激活蛋白。有些基因在沒有激活蛋白存在時，RNA 聚合酶很少或根本不能結合啟動子，所以基因不能轉錄。
阻遏蛋白、特異因子和激活蛋白等原核調控蛋白都是一些 DNA結合蛋白。凡是能夠誘導基因表 達的分子稱為誘導劑，而凡是能夠阻遏基因表達的分子稱為阻遏劑。

乳糖操縱子是典型的誘導型調控

操縱子在原核基因表達調控中具有普遍意義。大多數原核生物的多個功能相關基因串聯在一起，依賴同一調控序列對其轉錄進行調節，使這些相關基因實現協調表達盡。以大腸桿菌的乳糖操縱子(lac operon)為例介紹原核生物的操縱子調控模式。乳糖代謝酶基因的表達特點是：在環境中沒有乳糖時，這些基因處於關閉狀態；只有當環境中有乳糖時，這些基因才被誘導開放，合成代謝乳糖所需要的酶。乳糖操縱子是最早發現的原核生物轉錄調控模式。

乳糖操縱子的結構

E.coli的乳糖操縱子含Z、Y及A三個結構基因，分別編碼β-半乳糖苷酶(β-galactosidase)、通透酶(permease)和乙醯基轉移酶(acetyltransferase), 此外還有個操縱序列O(operator, O)、一個啟動子P (promoter, P)及個調節基因I。I基因具有獨立的啟動子(PI),編碼一種阻遏蛋白，後者與O序列結合，使操縱子受阻遏而處於關閉狀態。在啟動子P上游還有一個CAP結合位點。由P序列、O序列 和CAP結合位點共同構成乳糖操縱子的調控區，三個酶的編碼基因即由同一調控區調節，實現基因表達產物的協同表達。

乳糖操縱子受到阻遏蛋白和CAP的雙重調節

1、阻遏蛋白的負性調節 在沒有乳糖存在時，lac操縱子處於阻遏狀態。此時，I序列在PI 啟動序列作用下表達的Lac阻遏蛋白與O序列結合，阻礙RNA聚合酶與P序列結合，抑制轉錄啟動。 阻遏蛋白的阻遏作用並非絕對，偶有阻遏蛋白與0序列解聚。因此，每個細胞中可能會有寥寥數個分子的β-半乳糖苷酶、通透酶生成。
當有乳糖存在時，lac操縱子即可被誘導。在這個操縱子體系中，真正的誘導劑並非乳糖本身。 乳糖經通透酶催化、轉運進入細胞，再經原先存在於細胞中的少數β-半乳糖苷酶催化，轉變為別乳糖 (allolactose)。後者作為一種誘導劑分子結合阻遏蛋白，使蛋白質構象變化，導致阻遏蛋白與O序列解離而發生轉錄，可使β-半乳糖昔酶分子增加達1000倍。別乳糖的類似物異丙基硫代半乳糖苷(isopropylthiogalactoside, IPTG) 是一種作用極強的誘導劑，不被細菌代謝而十分穩定，因此在基因工程領域和分子生物學實驗中被廣泛應用。
2、CAP的正性調節 CAP是同二聚體，在其分子內有DNA結合區及cAMP結合位點。當培養基中缺乏葡萄糖時，cAMP 濃度增高，cAMP 與 CAP 結合，這時 CAP 結合在 lac啟動序列附近的 CAP 位點，可刺激 RNA 聚合酶轉錄活性，使之提高 50 倍；當有葡萄糖存在時，cAMP 濃度降低，cAMP與CAP 結合受阻，因此 lac 操縱子表達下降。
由此可見，對 lac 操縱子來說，CAP 是正性調節因素，Lac 阻遏蛋白是負性調節因素。兩種調節機制根據存在的碳源性質及水平協調調節 lac 操縱子的表達。
3、協同調節 Lac 阻遏蛋白負性調節與 CAP 正性調節兩種機制協同合作: 當 Lac 阻遏蛋白阻遏轉錄時，CAP 對該系統不能發揮作用；但是如果沒有 CAP存在來加強轉錄活性，即使阻遏蛋白從操縱序列上解離仍幾無轉錄活性。可見，兩種機制相輔相成、互相協調、相互制約。由於野生型lac啟動子作用很弱，所以 CAP 是必不可少的。
lac 操縱子的負調節能很好地解釋在單純乳糖存在時，細菌是如何利用乳糖作為碳源的。然而，細菌生長環境是複雜的，倘若有葡萄糖或葡萄糖／乳糖共同存在時，細菌首先利用葡萄糖才是最節能的。這時，葡萄糖通過降低 cAMP 濃度，阻礙 cAMP 與 CAP 結合而抑制 lac 操縱子轉錄，使細菌只能利用葡萄糖。葡萄糖對lac操縱子的阻遏作用稱分解代謝阻遏(catabolic repression)。lac操縱子強的誘導作用既需要乳糖存在又需要缺乏葡萄糖。

色氨酸操縱子通過阻遏作用和衰減作用抑制基因表達

原核生物體積小，受環境影響大，在生存過程中需要最大限度減少能源消耗，對非必需胺基酸都儘量關閉其編碼基因。例如，只要環境中有相應的胺基酸供應，大腸桿菌就不會自己去合成，而會將相應胺基酸的合成代謝酶編碼基因全部關閉。大腸桿菌色氨酸操縱子(trp operon) 就是一個阻遏操縱子。在細胞內無色氨酸時，阻遏蛋白不能與操縱序列結合，因此色氨酸操縱子處於開放狀態，結構基因得以表達。當細胞內色氨酸的濃度較高時，色氨酸作為輔阻遏物與阻遏蛋白形成複合物並結合到操縱序列上，關閉色氨酸操縱子，停止表達用於合成色氨酸的各種酶。
色氨酸操縱子的有效關閉還有一種屬於促進巳經開始轉錄的mRNA合成終止的方式來進一步加強，這種方式稱為轉錄衰減(transcription attenuation) , 即色氨酸操縱子還可通過轉錄衰減的方式抑制基因表達。這種作用是利用原核生物中轉錄與翻譯過程偶聯進行，轉錄時先合成的一段前導序列L來實現的。
前導序列L的結構特點是：①它可以轉錄生成一段長度為162bp、內含4個特殊短序列的前導mRNA;②其中序列l有獨立的起始和終止密碼子，可翻譯成為一個有14個胺基酸殘基的前導肽，它的第10位和第11位都是色氨酸殘基；③序列1和序列2間、序列2和序列3間、序列3和序列4間存在一些互補序列，可分別形成髮夾結構，形成發卡結構的能力依次是 1/2髮夾＞2/3髮夾＞3/4 髮夾；④序列4的下游有一個連續的U序列，是一個不依賴於p因子的轉錄終止信號。
轉錄衰減的機制是：①色氨酸濃度較低時，前導肽的翻譯因色氨酸量的不足而停滯在第10/11 的色氨酸密碼子部位，核糖體結合在序列l上，因此前導mRNA傾向於形成 2/3 髮夾結構，轉錄繼續進行；②色氨酸濃度較高時，前導肽的翻譯順利完成，核糖體可以前進到序列2,因此髮夾結構在序列3和序列4形成，連同其下游的多聚U使得轉錄中途終止，表現出轉錄的衰減。原核生物這種在色氨酸濃度高時通過阻遏作用和轉錄衰減機制共同關閉基因表達的方式，保證了營養物質和能量的合理利用。
前導序列發揮了隨色氨酸濃度升高而降低轉錄的作用，故將這段序列稱為衰減子(attenuator )。在trp操縱子中，阻遏蛋白對結構基因轉錄的負調節起到粗調的作用，而衰減子起到精調的作用。細菌中其他胺基酸合成系統的操縱子（如phe、his、leu、thr等）中也有類似的衰減調控機制。

原核基因表達在翻譯水平受到精細調控

與轉錄類似，翻譯一般在起始和終止階段受到調節，尤其是起始階段。翻譯起始的調節主要靠調 節分子，調節分子可直接或間接決定翻譯起始位點能否為核糖體所利用。調節分子可以是蛋白質 ，也可以是RNA。

蛋白質分子結合於啟動子或啟動子周圍進行自我調節

無論是單順反子還是多順反子mRNA,許多體系應用了類似的機制，即調節蛋白結合mRNA靶位點，阻止核糖體識別翻譯起始區，從而阻斷翻譯的機制。調節蛋白一般作用於自身mRNA,抑制自身的合成，因而這種調節方式稱為自我控制(autogenous control)。細菌mRNA 起始密碼子上游約10個核苷酸之前的SD序列與16和RNA 序列互補的程度以及從起始密碼子AUG到嘌呤片段的距離也都強烈地影響翻譯起始的效率。不同基因的mRNA有不同的SD序列，它們與16S rRNA的結合能力也不同，從而控制着單位時間內翻譯過程中起始複合物形成的數目，最終控制着翻譯的速度。

翻譯阻遏利用蛋白質與自身mRNA的結合實現對翻譯起始的調控

翻譯起始與轉錄 起始相類似，也受調節蛋白的作用，但與轉錄 不同，RNA在翻譯起始過程中有重要的作用。編碼區的起始點可與調節分子（蛋白質或RNA)直接或間接地結合來決定翻譯起始。在此調控機制中，調節蛋白可以結合到起始密碼子上，阻斷與核糖體的結合。例如，S8是組成核糖體小亞基的一個蛋白質，可以與16S rRNA的莖環結構結合；L5是組成核糖體大亞基的一個蛋白質，它的mRNA的5'-末端也能形成一個與16SrRNA的莖環結構相類似的結構。因此S8也能與L5的mRNA結合。當16SrRNA含量充足時，可以與所有的S8蛋白結合，不影響L5蛋白質的合成；而當16S rRNA含量不足時，多餘的S8則與L5 mRNA結合，阻遏L5蛋白質的合成，防止L5合成過量。

反義RNA利用結合mRNA翻譯起始部位的互補序列調節翻譯起始

此外，在一些細菌和病毒中還存在一類調節基因，能夠轉錄產生反義RNA(antisense RNA)。反義RNA含有與特定mRNA 翻譯起始部位互補的序列，通過與mRNA雜交阻斷30S小亞基對起始密碼子 的識別及與SD序列的結合，抑制翻譯起始。這種調節稱為反義控制(antisense control)。反義RNA的調節作用具有非常重要的理論意義和實際意義。

mRNA密碼子的編碼頻率影響翻譯速度

遺傳密碼表顯示，除色氨酸和甲硫氨酸外，其他的胺基酸都有2個或2個以上的遺傳密碼子。有些是使用頻率較高的常用密碼子，而有些則是使用頻率較低的稀有密碼子。當基因中的密碼子是常用密碼子時，mRNA的翻譯速度快，反之，mRNA的翻譯速度慢。大腸桿菌dnaG基因是引物酶的編碼基因，含有較多的稀有密碼子，使得mRNA的翻譯速度緩慢，防止引物酶合成過多。