生物化學與分子生物學/DNA實驗技術/Southern Blot原理及實驗方法

Southern Blot原理

將待檢測的DNA分子用/不用限制性內切酶消化後，通過瓊脂糖凝膠電泳進行分離，繼而將其變性並按其在凝膠中的位置轉移到硝酸纖維素薄膜或尼龍膜上，固定後再與同位素或其它標記物標記的DNA或RNA探針進行反應。如果待檢物中含有與探針互補的序列，則二者通過鹼基互補的原理進行結合，游離探針洗滌後用自顯影或其它合適的技術進行檢測，從而顯示出待檢的片段及其相對大小。 

用途

檢測樣品中的DNA及其含量，了解基因的狀態, 如是否有點突變、擴增重排等。

試劑和器材

試劑

變性液：1.5mol/L NaCl，0.5mol/L NaOH。

中和液：0.5mol/L Tris-HCl (pH=7.0)，1.5mol/L NaCl。

20×SSC：3mol/L NaCl，0.3mol/L 檸檬酸鈉。

以上溶液均在100Kpa滅菌20分鐘。

2×SSC：用無菌移液管吸取20×SSC溶液5mL，加無菌水45mL。

6×SSC：用無菌移液管吸取20×SSC溶液15mL，加無菌水75mL。

器材

22cm×15cm瓷盤

操作方法

1. 在瓊脂糖凝膠上電泳分離DNA。取出凝膠，切去邊緣多於部分，EB染色，在紫外燈下照相（放一標尺，可從像片中讀出DNA遷移的距離）。
2. 將凝膠置於200mL變性液中，浸泡45分鐘，並溫和地不斷振盪，使凝膠上的ds-DNA轉變為ss-DNA，然後用重蒸水沖洗凝膠幾次。
3. 用中和液浸泡凝膠並不斷地振盪45分鐘，將凝膠中和至中性。防止凝膠的鹼性破壞硝酸纖維膜。
4. 取一個瓷盤，在底部放一塊玻璃板（或一塊海綿）使盛器內的20倍SSC轉移濾液低於玻板表面，在玻板表面蓋一張3mm的二號濾紙，濾紙兩邊浸沒於20倍SSC溶液中，在玻璃和濾紙之間，趕掉所有的氣泡。
5. 把凝膠底面朝上放在濾紙上，趕走兩層之間出現的氣泡。
6. 裁剪一張硝酸纖維膜，其長與寬大於凝膠1—2mm，並在角上作記號，以確定濾膜方位。先把它放在去離子水中潤濕後，再放在20倍SSC溶液中潤濕5分鐘，然後放在凝膠表面，兩層之間不可有氣泡。
7. 然後再把兩張與濾膜一樣大小的二號濾紙，在2倍SSC溶液中浸濕，覆蓋在硝酸纖維膜上，同樣要把氣泡趕走。
8. 把一疊吸水紙（或衛生紙，約有5—8cm高，略小於濾紙），放置在濾紙上，在吸水紙上再放一塊玻璃板和重約500g的重物，放置過夜。
9. 轉移結束後，移去上面的吸水紙和濾紙，同時翻轉取出凝膠與硝酸纖維膜，把凝膠的點樣與硝酸纖維膜的相對應位置用鉛筆或解剖針的針尖做好標記。
10. 把已轉移了DNA的硝酸纖維膜放在6倍SSC溶液中振盪浸泡5分鐘，然後放在濾紙上吸乾溶液。再把它夾在兩層濾紙之間，80℃真空乾燥2小時。

注意事項

1. 將凝膠中和至中性時，要測pH, 防止凝膠的鹼性破壞硝酸纖維膜。
2. 要注意趕走凝膠和濾紙及硝酸纖維素膜之間的氣泡。

SDS-PAGE實驗原理及注意事項

SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳技術首先在1967年由Shapiro建立，1969年由Weber和Osborn進一步完善。

原理  

  聚丙烯醯胺凝膠是由丙烯醯胺 (簡稱Acr) 和交聯劑N，N』—亞甲基雙丙烯醯胺（簡稱Bis）在催化劑作用下，聚合交聯而成的具有網狀立體結構的凝膠，並以此為支持物進行電泳。 聚丙烯醯胺凝膠電泳可根據不同蛋白質分子所帶電荷的差異及分子大小的不同所產生的不同遷移率將蛋白質分離成若干條區帶，如果分離純化的樣品中只含有同一種蛋白質，蛋白質樣品電泳後，就應只分離出一條區帶。SDS是一種陰離子表面活性劑能打斷蛋白質的氫鍵和疏水鍵，並按一定的比例和蛋白質分子結合成複合物，使蛋白質帶負電荷的量遠遠超過其本身原有的電荷，掩蓋了各種蛋白分子間天然的電荷差異。因此，各種蛋白質-SDS 複合物在電泳時的遷移率，不再受原有電荷和分子形狀的影響，而只是棒長的函數。這種電泳方法稱為SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳（簡稱SDS—PAGE）。由於SDS-PAGE 可設法將電泳時蛋白質電荷差異這一因素除去或減小到可以略而不計的程度，因此常用來鑑定蛋白質分離樣品的純化程度，如果被鑑定的蛋白質樣品很純，只含有一種具三級結構的蛋白質或含有相同分子量亞基的具四級結構的蛋白質，那麼SDS—PAGE 後，就只出現一條蛋白質區帶。SDS—PAGE 可分為圓盤狀和垂直板狀、連續系統和不連續系統。本實驗採用垂直板狀不連續系統。所謂「不連續」是指電泳體系由兩種或兩種以上的緩衝液、pH 和凝膠孔徑等所組成。

樣品的濃縮效應

  在不連續電泳系統中，含有上、下槽緩衝液(Tris—Gly，pH8.3)、濃縮膠緩衝液(Tris—HCl，pH6.8)、分離膠緩衝液(Tris—HCl，pH8.8)，兩種凝膠的濃度(即孔徑)也不相同。在這種條件下，緩衝系統中的HCl 幾乎全部解離成Cl－，兩槽中的Gly (pI＝6.0，pK a=9.7)只有很少部分解離成Gly 的負離子，而酸性蛋白質也可解離出負離子。這些離子在電泳時都向正極移動。C1—速度最快(先導離子)，其次為蛋白質，Gly 負離子最慢(尾隨離子)。由於C1—很快超過蛋白離子，因此在其後面形成一個電導較低、電位梯度較陡的區域，該區電位梯度最高，這是在電泳過程中形成的電位梯度的不連續性，導致蛋白質和Gly 離子加快移動，結果使蛋白質在進入分離膠之前，快、慢離子之間濃縮成一薄層，有利於提高電泳的解像度。

分子篩效應

蛋白質離子進入分離膠後，條件有很大變化。由於其pH 升高(電泳進行時常超過9.0)，使Gly 解、離成負離子的效應增加；同時因凝膠的濃度升高，蛋白質的泳動受到影響，遷移率急劇下降。此兩項變化，使Gly 的移動超過蛋白質，上述的高電壓梯度不復存在，蛋白質便在一個較均一的pH 和電壓梯度環境中，按其分子的大小移動。分離膠的孔徑有一定的大小，對不同相對分子質量的蛋白質來說，通過時受到的阻滯程度不同，即使淨電荷相等的顆粒，也會由於這種分子篩的效應，把不同大小的蛋白質相互分開。

注意事項

1. SDS與蛋白質的結合按質量成比例（即：1.4gSDS/g蛋白質），蛋白質含量不可以超標，否則SDS結合量不足。
2. 用SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳法測定蛋白質相對分子量時，必須同時作標準曲線。不能利用這次的標準曲線作為下次用。並且SDS-PAGE測定分子量有10％誤差，不可完全信任。
3. 有些蛋白質由亞基（如血紅蛋白）或兩條以上肽鏈（α-胰凝乳蛋白酶）組成的，它們在巰基乙醇和SDS的作用下解離成亞基或多條單肽鏈。因此，對於這一類蛋白質，SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳法測定的只是它們的亞基或是單條肽鏈的相對分子量。
4. 有的蛋白質（如：電荷異常或結構異常的蛋白質；帶有較大輔基的蛋白質）不能採用該法測相對分子量。
5. 如果該電泳中出現拖尾、染色帶的背景不清晰等現象，可能是SDS不純引起。

印跡法（blotting）

印跡法（blotting）是指將樣品轉移到固相載體上，而後利用相應的探測反應來檢測樣品的一種方法。1975年，Southern建立了將DNA轉移到硝酸纖維素膜（NC膜）上，並利用DNA－RNA雜交檢測特定的DNA片段的方法，稱為Southern印跡法。而後人們用類似的方法，對RNA和蛋白質進行印跡分析，對RNA的印跡分析稱為Northern印跡法，對單向電泳後的蛋白質分子的印跡分析稱為Western印跡法，對雙向電泳後蛋白質分子的印跡分析稱為Eastern印跡法。

Western Blot基本原理：在電場的作用下將電泳分離的多肽從凝膠轉移至一種固相支持體，然後用這種多肽的特異抗體來檢測。

一般步驟：蛋白樣品的製備（SDS聚丙烯醯胺凝膠電泳）

• 轉膜
• 封閉
• 一抗雜交
• 二抗雜交
• 底物顯色

SDS-PAGE原理

SDS 是一種離子性的界面活性劑,它有強離子性的硫酸根離子也帶有疏水性的長碳鏈.當 SDS 與蛋白質混合時,它會以其碳鏈與蛋白質之疏水性胺基酸結合將蛋白質包起來,而以硫酸根離子外露與水分子作用。大多數蛋白質和 SDS 的平均結合量是 1:1.4 (以重量為單位)，而蛋白質結合固定比例之 SDS 後,由於 SDS 帶強負價,使蛋白質原先的帶電價微不足道，且每單位重量之蛋白質帶電價一致 (charge density),所以決定不同蛋白的泳動速率就只剩下分子大小一項因素。

Western Blot常見問題分析

SDS-PAGE電泳

膠不平？凝膠漏液？

• 膠板洗刷乾淨
• 加入APS和TEMED的量要合適
• 加入試劑後搖勻，使其充分混合，防止部分膠塊聚合不均勻
• 溫度合適，受熱不均勻導致膠聚合不均勻
• 兩塊玻璃板底部要對齊

條帶比正常的窄？「微笑」或「倒微笑」條帶？

• 凝膠聚合不均勻，灌膠時候儘量混合均勻，動作輕緩
• 拔梳子要迅速，清洗加樣孔要小心，以免把上樣帶扭曲
• 樣品鹽濃度過高會擠壓其他條帶導致寬窄不一，純化樣品，調整鹽濃度
• 膠板底部有氣泡會影響電泳效果，應趕走氣泡。同時注意電泳槽裝置是否合適

轉膜及抗體檢測

凝膠腫脹或捲曲？條帶歪斜或漂移？單個或多個白點？轉膜緩衝液過熱？

• 可將凝膠在轉膜之前放到轉膜緩衝液中浸泡5-10min
• 電轉儀長期使用導致海綿變薄，「三明治」結構不緊湊導致。可在兩塊海綿之間墊上少許普通的草紙
• 確保膜和膠塊之間沒有氣泡
• 緩衝液中離子濃度太低，電流或電壓太高。轉膜過程注意降溫

背景太高

原因

1. 膜沒有均勻浸濕
2. 膜或者緩衝液污染
3. 封閉不充分
4. 抗體與封閉劑出現交叉反應
5. 抗體濃度過高

對策

1. 轉膜前用100%甲醇將膜完全浸濕
2. 拿取膜與吸水紙時要戴手套，更換新鮮轉膜緩衝液
3. 檢測一抗、二抗與封閉劑是否有交叉反應
4. 雜交前檢測一抗、二抗的工作濃度