生物化學與分子生物學/PCR實驗技術/原位PCR操作步驟

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在科學研究中,每一項新技術的創立都會帶來一系列新的研究成果問世,從而推動着各學科的發展。縱觀形態研究領域,50年代電子顯微鏡引入形態學觀察領域,帶來了從細胞水平到亞細胞水平的深入研究;60-70年代,免疫組織化學與免疫細胞化學技術的廣泛應用,又將觀察的水平由亞細胞結構推向了蛋白質分子水平,使細胞內眾多的活性物質得以進行細胞或亞細胞水平的定位,對醫學生物學的發展無疑產生了深刻的影響。70年代,分子生物學技術在形態學中的廣泛應用,隨着原位雜交技術的出現,使組織細胞內特定的DNA或RNA序列能夠被定位,將蛋白質水平又提高到基因水平即核酸分子的觀察和定位,從而使人類對許多生命現象在基因水平上的認識得以深化;80年代,分子生物學領域中一項具有強大生命力的技術PCR——多聚酶鏈反應技術問世了,很快地就被引入形態學觀察的領域,使細胞內低拷貝或單拷貝的特定DNA或RNA得以進行定位及觀察。這一技術的問世,必將帶來更多的研究成果,使形態學的研究又向前邁出一大步。

基本原理[編輯]

原位PCR技術的基本原理,就是將PCR技術的高效擴增與原位雜交的細胞定位結合起來,從而在組織細胞原位檢測單拷貝或低拷貝的特定的DNA或RNA序列。

PCR技術是在DNA聚合酶的作用下,經過模板的變性、退火和引物延伸三種循環,將引物引導下的特異性靶序列迅速地進行擴增,經過擴增的靶序列(一般能擴增106倍),很容易在凝膠電泳或Southern印記雜交中顯示出來,因此,PCR技術具有靈敏度高,特異性強的優勢,隨着熱循環自動化的提高與穩定也使得PCR技術的操作簡便易行。但是,PCR技術是在液相中進行的,在擴增前,需將細胞破壞,從中提取核酸作為模板,因此很難將PCR的結果與組織細胞的形態結構聯繫起來,同時,也很難判斷含特異性靶序列的細胞類型。

原位PCR技術成功地將PCR技術和原位雜交技術結合起來,保持了兩項技術的優勢又彌補了各自的不足。原位PCR技術的待檢標本一般先經化學固定,以保持組織細胞的良好形態結構。細胞膜和核膜均具有一定的通透性,當進行PCR擴增時,各種成分,如引物,DNA聚合酶,核苷酸等均可進入細胞內或細胞核內,以固定在細胞內或細胞核內的RNA或DNA為模板,於原位進行擴增。擴增的產物一般分子較大,或互相交織,不易穿過細胞膜或在膜內外彌散,從而被保留在原位。這樣原有的細胞內單拷貝或低拷貝的特定DNA或RNA序列在原位以呈指數極擴增,擴增的產物就很容易被原位雜交技術檢查。

基本類型[編輯]

根據在擴增反應中所用的三磷酸核苷原料或引物是否標記,原位PCR技術可分為直接法和間接法兩大類,此外,還有反轉錄原位PCR技術等。

直接法原位PCR技術[編輯]

直接法原位PCR技術是將擴增的產物直接攜帶標記分子,即使用標記的三磷酸腺苷或引物片斷。當標本進行PCR擴增時,標記的分子就摻入到擴增的產物中,顯示標記物,就能將特定的DNA或RNA在標本(原位)中顯現出來。

常用的標記物有放射性同位素35S,生物素和地高辛,用放射性自顯影的方法或用親和組織化學及免疫組織化學的方法去顯示標記物所在位置。

直接法原位PCR技術的優點是操作簡便,流程短,省時。缺點是特異性較差,易出現假陽性,擴增效率也較低,特別是在石蠟切片上,上述缺點更為突出。因為在製片過程中,無論是固定,脫水還是包埋,都會導致DNA的損害,而受損的DNA可利用反應體系中的標記三磷酸核苷進行修復,這樣標記物就會摻入到DNA的非靶序列中,造成假陽性。若用標記引物的方法進行直接法原位PCR,其擴增的效率比不標記更低。

間接法原位PCR技術[編輯]

間接法原位PCR技術師現在細胞內進行特定DNA或RNA擴增,再用標記的探針進行原位雜交,明顯提高了特異性,是目前應用最為廣泛的原位PCR技術。

間接法原位PCR與直接法不同的是,反應體系與常規PCR相同,所用的引物或三磷酸腺苷均不帶任何標記物。即實現先擴增的目的,然後用原位雜交技術去檢測細胞內已擴增的特定的DNA產物,因此,實際上是將PCR技術和原位雜交技術結合起來的一種新技術,故又稱之為PCR原位雜交(PCR in situ hybridization , PISH)。

間接法PCR技術的優點是特異性較高,擴增效率也較高。缺點是操作步驟較直接法繁瑣。

原位反轉錄PCR技術[編輯]

原位反轉錄PCR(in situ reverse transcription PCR, In Situ RT-PCR)是將液相的RT-PCR技術應用到組織細胞標本中的一種新技術,與RT-PCR(液相)不同點在於,進行原位反轉錄PCR反應之前,組織標本要先用DNA酶處理,以破壞組織中的DNA酶,這樣才能保證擴增的模板是從mRNA反轉錄合成的cDNA,而不是細胞中原有的DNA。其它基本步驟與液相的RT-PCR相似。

基本步驟[編輯]

原位PCR技術的基本步驟包括標本的製備。原位擴增(PCR)及原位檢測等基本環節,現分述如下(重點以石蠟切片為例)。

標本的製備[編輯]

原位PCR技術可應用於細胞懸液、細胞塗片、冰凍切片以及石蠟切片。相比較而言,以懸浮的完整細胞做原位PCR效果最好,石蠟切片效果最差。隨着技術方面的一些問題被解決,近年也有從石蠟切片中得到滿意的PCR效率的報道。效果不好的原因是多方面的,如:玻片上做PCR,熱傳導較差,熱對流不均勻,TaqDNA酶被玻璃片吸附等,更為主要的原因,可能是標本經製片後,細胞缺乏完整的胞漿或核膜,擴增產物易發生瀰漫而導致擴增的產物在原位不易保留。絕大多數的病理標本都是以福爾馬林固定,石蠟包埋的形式保存的,若能很好地解決石蠟切片原位PCR的有關技術問題,意義顯然是十分重大的。

組織細胞的固定[編輯]

一般認為組織細胞以10%的緩衝福爾馬林或4%的多聚甲醛固定後進行原位PCR效果較好。固定的時間一般不宜過長,視組織的大小,一般以4℃4-6小時為宜。

切片的厚度[編輯]

 一般而言,切片若厚一些,原位PCR的效果也較好一些,因為切片越厚,靶DNA的含量也就越多,同時膜結構也較多,防止擴增產物彌散的作用也越明顯。但厚切片細胞重疊多,形態學觀察的效果就差了,解像度也將下降。

玻片的處理[編輯]

為防止石蠟切片在PCR和原位雜交過程中脫落,在玻片應作防脫片處理,常用的方法是塗以多聚賴氨酸或用矽烷化處理,一般能防止組織脫落。

蛋白酶的消化作用[編輯]

在進行原位擴增之前,組織標本需經蛋白酶處理。經蛋白酶消化的組織細胞,可增加其通透性,充分允許反應體系中的各成分進入細胞內,並能很好的暴露靶序列,以利於擴增。常用的蛋白酶有蛋白酶K,胰蛋白酶或胃蛋白酶。蛋白酶消化的程度就要根據組織固定的程度進行調整。蛋白酶消化後,要注意加熱以滅活酶的活性或通過充分的洗滌將酶完全去除,因為只要有少量的殘留酶存在,都將對隨後進行的PCR反應體系的數量TaqDNA酶產生毀滅性的影響。

蛋白酶消化處理組織細胞可提高通透性,有利於後續進行的各反應成分進入細胞內或核內,但同時也使得擴增產物的彌散機會增多,有可能帶來假陽性或假陰性的結果。

原位擴增(PCR)[編輯]

原位擴增即在組織細胞標本上進行PCR反應,其基本原理與液相PCR完全相同。

引物[編輯]

PCR所用的引物一般為15-30bp為宜,擴增的片斷為100-1000bp左右。原位PCR宜用較短的引物。從石蠟切片中提取的DNA很少超過400bp,RNA很少超過200bp,較長序列的擴增易引起引物與模板的錯配而導致非特異性反應的出現。

反應體系[編輯]

原位PCR的反應體系與常規的液相PCR基本相同,由於是在經過固定的組織切片上進行,為獲得較好的擴增效果,有人主張反應體系中的引物,TaqDNA聚合酶以及Mg2+的濃度均應高於液相的PCR反應體系。在反應體系中要加入牛血清白蛋白(BSA),以防止TaqDNA聚合酶與玻片的結合而降低了擴增效率。

熱循環[編輯]

原位PCR的熱循環可在專門的熱循環儀上進行,操作簡便。也可在一般的PCR熱循環儀上進行,通常在樣品台上覆蓋一層鋁箔,製成平台,樣品台上的空間用礦物油或水充填,將載玻片至於平台上,即可進行熱循環的步驟。

為了保證進行充分的擴增,原位PCR熱循環中每一步驟的時間可比常規PCR略長些,另外,也可採用熱啟動(hot start)的方法,即玻片加熱到80-94℃時,再立即加入TaqDNA聚合酶。

為了保證反應體系在熱循環過程不過多丟失,可用清亮的指甲油,礦物油或PAP筆把蓋片四周封閉起來。

洗滌[編輯]

原位擴增結束後,標本應清洗,以除去彌散到細胞外的擴增產物。洗滌不充分,會導致擴增產物在檢測時顯現,造成背景過深或假陽性結果的出現。但是,洗滌過度,也會造成細胞內擴增的產物被洗脫,是陽性信號減弱或丟失。

有作者在擴增後用4%多聚甲醛2小時或2%戊二醛5分鐘進行後固定,以使擴增的產物在檢測時能很好地保留在細胞內,提高檢測的敏感性和特異性。

原位檢測[編輯]

原位PCR的擴增產物檢測方法,取決於原位PCR的設計方案,直接法則根據標記分子的性質對擴增產物直接進行原位檢測。間接法則需用原位雜交的方法進行檢測。

熒光素、生物素、鹼性磷酸酶或辣根過氧化物酶標記的檢測,與免疫組織化學技術和親和組織化學技術相同,詳見前述。

原位雜交的基本步驟詳見核酸雜交一章。

原位PCR技術的應用[編輯]

原位PCR技術的突出優勢,就是能在組織細胞原位檢測出拷貝數較低的特異性基因序列。按照待測基因的性質,可將原位PCR的應用分為檢測外源性基因和內源性基因兩方面。

用於外源性基因的檢測[編輯]

病毒基因的檢測[編輯]

感染病毒的細胞常無較好的檢測手段,但當原位PCR技術應用後,使這一極為困難的問題有望解決。

對HIV、HPV、HSV、HBV、HCV等多種病毒的檢測,使我們能夠成功等觀察到這些病毒在愛滋病、生殖系統腫瘤、肝炎及肝癌中的作用,能夠及時發現受感染的人群。

細菌基因的檢測[編輯]

最突出的應用是在結核桿菌的檢測上,當結核病變不夠典型時,經過特殊染色的方法(詳見第一篇第五章)很難在鏡下找到結核桿菌,而應用原位PCR技術可幫助明確診斷,當結核桿菌很少時仍能在鏡下被很容易地找出來。

導入基因的檢測[編輯]

在轉基因動物的研究中,是否導入了基因,在接受基因治療的患者體內,是否接受了導入的基因,均可用原位PCR技術來證實。因此,原位PCR技術成為重要的檢測手段。

用於內源性基因的檢測[編輯]

異常基因的檢測[編輯]

機體內基因的突變、重排、也可用原位PCR技術進行檢測,原癌基因,抑癌基因的突變,惡性淋巴瘤免疫球蛋白重鏈基因的重排,對腫瘤的研究和診斷無一均提供了廣闊的應用前景。

固有基因的檢測[編輯]

對於機體細胞內只有單個或幾個拷貝的低表達固有基因,原位雜交技術因基因拷貝數太少而無能為力,液相PCR雖可進行擴增檢測出來,但不能確定含有該基因的細胞類型,原位PCR技術則彌補了上述兩種技術的不足,使得我們能夠對人類各種基因進行檢測,而完成人類基因圖的繪製。

熒光原位雜交[編輯]

熒光原位雜交方法是一種物理圖譜繪製方法,使用熒光素標記探針,以檢測探針和分裂中期的染色體或分裂間期的染色質的雜交。

熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)是在20世紀80年代末在放射性原位雜交技術的基礎上發展起來的一種非放射性分子細胞遺傳技術,以熒光標記取代同位素標記而形成的一種新的原位雜交方法,探針首先與某種介導分子(reporter molecule)結合,雜交後再通過免疫細胞化學過程連接上熒光染料[1,2].FISH的基本原理是將DNA(或RNA)探針用特殊的核苷酸分子標記,然後將探針直接雜交到染色體或DNA纖維切片上,再用與熒光素分子偶聯的單株抗體與探針分子特異性結合來檢測DNA序列在染色體或DNA纖維切片上的定性、定位、相對定量分析.FISH具有安全、快速、靈敏度高、探針能長期保存、能同時顯示多種顏色等優點,不但能顯示中期分裂相,還能顯示於間期核.同時在熒光原位雜交基礎上又發展了多彩色熒光原位雜交技術和染色質纖維熒光原位雜交技術.

對於利用rRNA的熒光原位雜交來說,如下原因可導致較低的熒光信號強度:

  • 較低的細胞核糖體含量
  • 較低的細胞周邊的通透性

較低的目標序列可接觸性(由於rRNA的摺疊產生的構象,有些位置與rRNA分子內其他鏈或其他rRNA或蛋白緊密接觸,從而使探針無法和目標序列雜交)

為檢驗細胞中的目標序列是否容易被探針雜交,及測試最佳雜交溫度,可利用「克隆熒光原位雜交」(clone-FISH)進行試驗:將rRNA基因結合入質體,轉化至大腸桿菌中表達,構成核糖體,再用熒光標記的探針雜交。

FISH可與流式細胞術聯用,對特定熒光標記的細胞進行計數或者分離。

熒光原位雜交(FISH)技術簡介[編輯]

1974年Evans首次將染色體顯帶技術和染色體原位雜交聯合應用,提高了定位的準確性。20世紀70年代後期人們開始探討熒光標記的原位雜交,即FISH技術。1981年Harper成功地將單拷貝的DNA序列定位到G顯帶標本上,標誌着染色體定位技術取得了重要進展。20世紀90年代,隨着人類基因組計劃的進行,由於繪製高分辨人類基因組圖譜的需要,FISH技術得到了迅速的發展和廣泛應用。

原理[編輯]

FISH(fluorescence in situ hybridization)技術是一種重要的非放射性原位雜交技術。它的基本原理是:如果被檢測的染色體或DNA纖維切片上的靶DNA與所用的核酸探針是同源互補的,二者經變性-退火-復性,即可形成靶DNA與核酸探針的雜交體。將核酸探針的某一種核苷酸標記上報告分子如生物素、地高辛,可利用該報告分子與熒光素標記的特異親和素之間的免疫化學反應,經熒光檢測體系在鏡下對待測DNA進行定性、定量或相對定位分析。

實驗流程[編輯]

FISH樣本的製備→探針的製備→探針標記→雜交→(染色體顯帶)→熒光顯微鏡檢測→結果分析。

特點[編輯]

原位雜交的探針按標記分子類型分為放射性標記和非放射性標記。用同位素標記的放射性探針優勢在於對製備樣品的要求不高,可以通過延長曝光時間加強信號強度,故較靈敏。缺點是探針不穩定、自顯影時間長、放射線的散射使得空間解像度不高、及同位素操作較繁瑣等。採用熒光標記系統則可克服這些不足,這就是FISH技術。FISH技術作為非放射性檢測體系,具有以下優點:1、熒光試劑和探針經濟、安全;2、探針穩定,一次標記後可在兩年內使用;3、實驗周期短、能迅速得到結果、特異性好、定位準確;4、FISH可定位長度在1kb的DNA序列,其靈敏度與放射性探針相當;5、多色FISH通過在同一個核中顯示不同的顏色可同時檢測多種序列;6、既可以在玻片上顯示中期染色體數量或結構的變化,也可以在懸液中顯示間期染色體DNA的結構。

缺點:不能達到100%雜交,特別是在應用較短的cDNA探針時效率明顯下降。

應用[編輯]

該技術不但可用於已知基因或序列的染色體定位,而且也可用於未克隆基因或遺傳標記及染色體畸變的研究。在基因定性、定量、整合、表達等方面的研究中頗具優勢。

熒光原位雜交技術的發展歷程[編輯]

FISH 技術檢測位點數目及檢測目標的發展[編輯]

在FISH 技術基本確立之後,FISH 不僅用於單基因或核酸檢測,FISH 技術的進一步發展擴展到多色FISH 多基因位點同時檢測,從基因檢測發展到基因組、染色體、活細胞中轉錄產物mRNAs 原位檢測以及組織水平的核酸檢測,並且在今後的研究中還有可能應用到整個生物體的檢測。早期的探針較大,是通過載體的增殖、缺口平移法、體外轉錄法和隨機引物DNA 合成法來製備以獲得特異性雜交克隆。然而大片斷的探針通常帶有重複序列造成高熒光背景,採用未標記的核酸進行預處理使其與非特異性位點結合用於抑制非特異性雜交可以克服上述問題,同時也使得研究者擴大了檢測目標,實現了整條染色體染色。在細胞遺傳學上FISH 技術在染色體分析方面也因此得到了顯著的提高。如通過比較基因組雜交(Comparativegenomic hybridization)用於檢測染色體區域的缺失和重複。大片段探針一旦和樣品非特異性結合就會形成一個信號,混淆染色體上基因的檢測,就需要剪切成小片段<200核苷酸。現在檢測手段的提高以及檢測軟件的不斷發展使得FISH技術的檢測要求越來越低,靈敏度越來越高。精確的計算機圖片處理算法的不斷改進形成了亞顯微水平的探針高分辨技術。隨着檢測目標越來越小,FISH技術已用於隱蔽的亞端粒核型基因重排和精確的染色體作圖及單拷貝mRNA的檢測。

FISH 檢測範圍的擴大,使得FISH 技術的應用在20 世紀90 年代急速增長。由FISH 技術應用而形成的分支技術實現了越來越多的不同類型位點同時檢測。首先是採用不同的熒光素來檢測多位點,如雙色熒光用於檢測特異的核酸序列,每一條染色體、基因或者轉錄產物分別由一種可以分辨的熒光信號來表示。之後是採用兩種色彩譯碼方案進一步擴大了FISH 應用範圍。譯碼方案主要是針對色彩比例,即每一種顏色在總顏色中所佔的比例來描繪多位點。前述的每一種方法,或是兩種方法的結合都已經將可檢測位點多達12 個。採用計算機翻譯的五色方案可同時檢測出人類所有染色體代表着FISH 技術多位點檢測的里程碑。儘管可以採用多種方法觀測到mRNAs,但是FISH 對整個轉錄產物的原位分析似乎更有應用前景。色彩譯碼技術已經實現了對整個組織的檢測。

FISH 技術的定量分析階段[編輯]

Pinkel 等(1986)首次將熒光圖像定量分析用於基本細胞遺傳檢測,採用雙色激發塊裝置照相機檢測熒光信號,而且定量分析技術很快用於了mRNA 檢測。熒光檢測的關鍵是信號的重現性、無規律性及背景的自發熒光。不僅不同的樣品之間熒光不同,而且同一載玻片上的材料或者同樣的細胞都有可能顯示出不均衡的熒光。目前已有多種方法用於消除一些組織中的自發熒光:如樣品製備過程中,採用的消除自發熒光試劑包括硼氫化鈉或者採用光照輻射進行預處理以消除非特異性背景信號。這些消除自發熒光的方法並不完全有效,通常在進行圖像分析時通過計算機算術除去自發熒光信號。熒光圖像的光譜數據包括真正的信號和許多雜噪,分別進行分析並且通過單獨的光譜組分分析除掉雜噪數據。多色FISH 有自身的限制,包括不同的熒光強度和顏色重疊。但是通過計算機算法分析平衡了多色圖像,包括強度變化和自動糾正信號重疊。

FISH圖像自身的限制並沒有影響到自動破譯算法的發展。採用序列較大探針進行DNA 位點檢測和多色熒光計數算法輔助病理學家實現了自動化分析。此外,檢測探針試劑盒和點計數方法的應用為便捷的檢測結果提供了一個平台。儘管多種方法已經用於分析或優化自動細胞檢測系統,人工的細胞病理檢測仍是可信度高的組織分析方法。然而,細胞製備、鑑別、固定介質上細胞樣品計算機化檢測在未來的醫學診斷中的高效益性不容忽視,快速檢測細胞內的分子信號只有通過計算機輔助方法進行檢測。現在,自動化檢測程序已經擴展到採用多基因轉錄模型檢測特異的DNA 簇和轉錄位點以確定功能細胞的狀態。

FISH 技術檢測領域的發展[編輯]

鑑於FISH 起始階段的發展主要是探針類型和檢測位點的擴展,熒光檢測技術將來的發展可能包括檢測領域的擴展。熒光圖像臨床診斷應用需要在檢測體系上進一步提高,如探針的結合,照相和分析的自動化,因此避免了不同操作間的誤差。樣品厚度是熒光顯微鏡檢測樣品類型的一個限制因素。近來的雷射共聚焦顯微鏡和光學X射線斷層攝影技術要求樣品厚度達到1~2mm。一種改進的光學投射X 顯微斷層攝影技術可以獲取到15mm 厚樣品的圖像擴大了生物學和診斷樣品的檢測範圍。活細胞的RNAs FISH 技術檢測也有報道。既可以採用體內釋放的熒光集團也可以採用雜交後探針的熒光素進行檢測。這兩種新方法都可以降低非特異性標記探針存在時的高背景(如活細胞),可以用於追蹤mRNA 的合成和轉移途徑。這些方法較綠色熒光蛋白(Green fluorescence protein, GFP)更易於檢測不同靶分子。相對於GFP 活細胞原位雜交檢測,FISH 易受到細胞內合成探針的影響。FISH 需要進一步的改進以降低活體基因表達檢測時的干擾背景,避免細胞內自身雜交物的干擾。其實完全可以不必考慮FISH 檢測和熒光檢測蛋白技術的差異,將FISH 技術和熒光蛋白技術結合起來可以同時檢測目的核酸和蛋白。

多光子顯微技術的應用進一步擴大了熒光圖像的應用範圍。採用多光子顯微鏡,雷射塊可以發射光子聚焦於顯微鏡兩到三次激發目的熒光素。採用近紅外激發光可以更深層次穿透生物樣品,比可見光對活體樣品造成的毒性低。這種新方法的應用已將熒光圖像用於活體系統的檢測,甚至整個動物體。由於還不能合成生物體標記探針,因此目前生物體內熒光圖像的應用只限於檢測熒光分子或生物體自發熒光。生物組織在正常的生理或者病理生理過程中產生的自發熒光信號可以作為一種重要的診斷信號。一旦生物體探針成為可能,將會成為鑑別特異核酸序列,進行非入侵診斷,獲取診斷圖像的一種有力輔助手段。