生物化學與分子生物學/PCR實驗技術/PCR操作步驟

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聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction,PCR)是體外酶促合成特異DNA片段的一種方法,為最常用的分子生物學技術之一。

典型的PCR由

  1. 高溫變性模板;
  2. 引物與模板退火;
  3. 引物沿模板延伸三步反應組成一個循環,通過多次循環反應,使目的DNA得以迅速擴增。

其主要步驟是:

  • 將待擴增的模板DNA置高溫下(通常為93℃-94℃)使其變性解成單鏈;
  • 人工合成的兩個寡核苷酸引物在其合適的復性溫度下分別與目的基因兩側的兩條單鏈互補結合,兩個引物在模板上結合的位置決定了擴增片段的長短;
  • 耐熱的DNA聚合酶(Taq酶)在72℃將單核苷酸從引物的3』端開始摻入,以目的基因為模板從5』→3』方向延伸,合成DNA的新互補鏈。

PCR能快速特異擴增任何已知目的基因或DNA片段,並能輕易在皮克(pg)水平起始DNA混合物中的目的基因擴增達到納克、微克、毫克級的特異性DNA片段。因此,PCR技術一經問世就被迅速而廣泛地用於分子生物學的各個領域。它不僅可以用於基因的分離、克隆和核苷酸序列分析,還可以用於突變體和重組體的構建,基因表達調控的研究,基因多態性的分析,遺傳病和傳染病的診斷,腫瘤機制的探索,法醫鑑定等諸多方面。通常,PCR在分子克隆和DNA分析中有着以下多種用途:

  • 生成雙鏈DNA中的特異序列作為探針;
  • 由少量mRNA生成 cDNA文庫;
  • 從cDNA中克隆某些基因;
  • 生成大量DNA以進行序列測定;
  • 突變的分析;
  • 染色體步移;
  • RAPD、AFLP、RFLP等DNA多態性分析等。

試劑準備[編輯]

  1. DNA模版
  2. 對應目的基因的特異引物
  3. 10×PCR Buffer
  4. 2mM dNTPmix:含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
  5. Taq酶

操作步驟[編輯]

第一步,在冰浴中,按以下次序將各成分加入一無菌0.5ml離心管中。

體系
試劑 用量
10×PCR buffer 5 μl
dNTP mix (2mM) 4 μl
引物1(10pM) 2 μl
引物2(10pM) 2 μl
Taq酶(2U/μl) 1 μl
DNA模板(50ng-1μg/μl) 1 μl
加ddH2O至 50 μl

視PCR儀有無熱蓋,不加或添加石蠟油。

第二步,調整好反應程序。將上述混合液稍加離心,立即置PCR儀上,執行擴增。一般:在93℃預變性3-5min,進入循環擴增階段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循環30-35次,最後在72℃ 保溫7min。

第三步,結束反應,PCR產物放置於4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。

第四步,PCR的電泳檢測:如在反應管中加有石蠟油,需用100μl氯仿進行抽提反應混合液,以除去石蠟油;否則,直接取5-10μl電泳檢測。

PCR反應體系的組成與反應條件的優化[編輯]

PCR反應體系由反應緩衝液(10×PCR Buffer)、脫氧核苷三磷酸底物(dNTPmix)、耐熱DNA聚合酶(Taq酶)、寡聚核苷酸引物(Primer1,Primer2)、靶序列(DNA模板)五部分組成。各個組份都能影響PCR結果的好壞。

  1. 反應緩衝液:一般隨Taq DNA聚合酶供應。標準緩衝液含:50mM KCl,10mM Tris-HCl(pH8.3室溫),1.5mM MgCl2。Mg2+的濃度對反應的特異性及產量有着顯著影響。濃度過高,使反應特異性降低;濃度過低,使產物減少。在各種單核苷酸濃度為200μM時,Mg2+為1.5mM較合適。若樣品中含EDTA或其它螯合物,可適當增加Mg2+的濃度。在高濃度DNA及dNTP條件下進行反應時,也必須相應調節Mg2+的濃度。據經驗,一般以1.5-2mM(終濃度)較好。
  2. dNTP :高濃度dNTP易產生錯誤摻入,過高則可能不擴增;但濃度過低,將降低反應產物的產量。PCR中常用終濃度為50-400μM的dNTP。四種脫氧三磷酸核苷酸的濃度應相同,如果其中任何一種的濃度明顯不同於其它幾種時(偏高或偏低),就會誘發聚合酶的錯誤摻入作用,降低合成速度,過早終止延伸反應。此外,dNTP能與Mg2+結合,使游離的Mg2+濃度降低。因此,dNTP的濃度直接影響到反應中起重要作用的Mg2+濃度。
  3. Taq DNA聚合酶酶:在100μl反應體系中,一般加入2-4U的酶量,足以達到每min延伸1000-4000個核苷酸的摻入速度。酶量過多將導致產生非特異性產物。但是,不同的公司或不同批次的產品常有很大的差異,由於酶的濃度對PCR反應影響極大,因此應當作預試驗或使用廠家推薦的濃度。當降低反應體積時(如20μl或50μl),一般酶的用量仍不小於2U,否則反應效率將降低。
  4. 引物:引物是決定PCR結果的關鍵,引物設計在PCR反應中極為重要。要保證PCR反應能準確、特異、有效地對模板DNA進行擴增,通常引物設計要遵循以下幾條原則:
    • 引物的長度以15-30bp為宜,一般(G+C)的含量在45-55%,Tm值高於55℃[Tm=4(G+C)+2(A+T)]。應儘量避免數個嘌呤或嘧啶的連續排列,鹼基的分佈應表現出是隨機的。
    • 引物的3』端不應與引物內部有互補,避免引物內部形成二級結構,兩個引物在3』端不應出現同源性,以免形成引物二聚體。3』端末位鹼基在很大程度上影響着Taq酶的延伸效率。兩條引物間配對鹼基數少於5個,引物自身配對若形成莖環結構,莖的鹼基對數不能超過3個由於影響引物設計的因素比較多,現常常利用計算機輔助設計。
    • 人工合成的寡聚核苷酸引物需經PAGE或離子交換HPLC進行純化。
    • 引物濃度不宜偏高,濃度過高有兩個弊端:一是容易形成引物二聚體(primer-dimer),二是當擴增微量靶序列並且起始材料又比較粗時,容易產生非特異性產物。一般說來,用低濃度引物不僅經濟,而且反應特異性也較好。一般用0.25-0.5pM/μl較好。
    • 引物一般用TE配製成較高濃度的母液(約100μM),保存於-20℃。使用前取出其中一部分用ddH2O配製成10μM或20μM的工作液。
  5. 模板:PCR對模板的要求不高,單、雙鏈DNA均可作為PCR的樣品。雖然PCR可以用極微量的樣品(甚至是來自單一細胞的DNA)作為摸板,但為了保證反應的特異性,一般還宜用μg水平的基因組DNA或104拷貝的待擴增片段作為起始材料。原材料可以是粗製品,某些材料甚至僅需用溶劑一步提取之後即可用於擴增,但混有任何蛋白酶、核酸酶、Taq DNA聚合酶抑制劑以及能結合DNA的蛋白,將可能干擾PCR反應。
  6. PCR循環加快,即相對減少變性、復性、延伸的時間,可增加產物的特異性。

注意事項[編輯]

  • PCR反應應該在一個沒有DNA污染的乾淨環境中進行。最好設立一個專用的PCR實驗室。
  • 純化模板所選用的方法對污染的風險有極大影響。一般而言,只要能夠得到可靠的結果,純化的方法越簡單越好。
  • 所有試劑都應該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應戴手套。
  • PCR試劑配製應使用最高質量的新鮮雙蒸水,採用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
  • 試劑都應該以大體積配製,試驗一下是否滿意,然後分裝成僅夠一次使用的量儲存,從而確保實驗與實驗之間的連續性。
  • 試劑或樣品準備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子,玻璃器皿應洗滌乾淨並高壓滅菌。
  • PCR的樣品應在冰浴上化開,並且要充分混勻。