生物化學與分子生物學/RNA實驗技術/MRNA的分離純化

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實驗原理[編輯]

真核生物的mRNA分子是單順反子,是編碼蛋白質的基因轉錄產物。真核生物的所有蛋白質歸根到底都是mRNA的翻譯產物,因此,高質量mRNA的分離純化是克隆基因、提高cDNA文庫構建效率的決定性因素。哺乳動物平均每個細胞含有約1x10-5g RNA,理論上認為每克細胞可分離出5~10mg RNA。其中rRNA為75%~ 85%,tRNA佔10%~16%,而mRNA僅佔1%~5%,並且mRNA分子種類繁多,分子量大小不均一,表達豐度也不一樣。

真核生物mRNA有特徵性的結構,即具有5』端帽子結構(m7G)和3』端的poly(A)尾巴——絕大多數哺乳動物細胞的3』端存在20~300個腺苷酸組成的poly(A)尾,通常用poly(A+)表示,這種結構為真核mRNA分子的提取、純化,提供了極為方便的選擇性標誌,寡聚(dT)纖維素或寡聚(U)瓊脂糖親合層析分離純化mRNA的理論基礎就在於此。

一般mRNA分離純化的原理就是根據mRNA 3』 末端含有多poly(A)尾巴結構特性設計的。當總RNA流經寡聚(dT)(即oligo(dT))纖維素柱時,在高鹽緩衝液作用下,mRNA被特異地吸附在oligo(dT)纖維素柱上,在低鹽濃度或蒸餾水中,mRNA可被洗下,經過兩次oligo(dT)纖維素柱,即可得到較純的mRNA。

目前常用的mRNA的純化方法有:

  1. 寡聚(dT)-纖維素柱層析法,即分離mRNA的標準方法;
  2. 寡聚(dT)-纖維素液相離心法,即用寡聚(dT)-纖維素直接加入到總的  RNA溶液中並使mRNA與寡聚(dT)-纖維素結合,離心收集寡聚(dT)-纖維素/mRNA複合物,再用洗脫液分離mRNA,然後離心除去寡聚(dT)-纖維素;
  3. 其它一些方法:如寡聚(dT)-磁性球珠法等。

本實驗應用方法(1)進行mRNA的分離純化作為示例。

試劑與器材[編輯]

試劑[編輯]

  1. 0.1mol/L NaOH ,每組200mL
  2. 寡聚Oligo(dT)-纖維素
  3. 加樣/洗滌緩衝液1:0.5 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6),每組250mL或0.5mol/L NaCl, 20mmol/L Tris-HCl(pH7.6), 1mmol/L EDTA(pH8.0), 0.1% SDS。
  4. 洗滌緩衝液2:0.1 mol/L NaCl, 20 m mol/L Tris-HCl(pH 7.6),每組250mL或10mmol/L Tris-HCl (pH7.6), 1mmol/L EDTA (pH8.0), 0.05% SDS。配製時可先配製Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA(pH 8.0)的母液,經高壓消毒後按各成分確切含量,經混合後再高壓消毒,冷卻至65℃時,加入經65℃溫育(30min)的10%SDS至終濃度。
  5. 5 mol/L NaCl,每組10mL
  6. 3 mol/L NaAc pH5.2,每組10mL
  7. 無RNase雙蒸水(DEPC水),每組100mL
  8. 70%乙醇,每組10mL

注意:溶液5,6的配製都應該加0.1% DEPC處理過夜,溶液1,3,4,8則用經0.1% DEPC處理過的無RNase雙蒸水配製,Tris應選用無RNase的級別。溶液配製後,最好能夠按一次實驗所需的分量分裝成多瓶(如10ml或50ml/瓶)保存,每次實驗只用一份,避免多次操作造成對溶液的污染。

器材[編輯]

  1. 恆溫水浴箱
  2. 冷凍高速離心機
  3. 紫外分光光度計
  4. 巴斯德吸管
  5. 玻璃棉
  6. 5ml一次性注射器

操作方法[編輯]

oligo(dT)纖維素的預處理[編輯]

  1. 用0.1mol/L NaOH懸浮0.5-1.0g oligo(dT)纖維素。
  2. 將懸浮液裝入填有經DEPC水處理並經高壓滅菌的玻璃棉的巴斯德吸管中,柱床體積為0.5-1.0mL,用3倍柱床體積的無RNase的滅菌雙蒸水沖洗oligo(dT)纖維素。
  3. 用3-5倍柱床洗滌緩衝液I沖洗oligo(dT)纖維素,直到流出液的pH值小於8.0。
  4. 將處理好的oligo(dT)纖維素從巴斯德吸管倒出,用適當的柱床洗滌緩衝液I懸浮,濃度約為0.1g/mL,保存在4℃待用。

總RNA濃度的調整[編輯]

  1. 把實驗一所提的總RNA轉到適合的離心管中,如果總RNA的濃度大於0.55mg/mL,則用無RNase的雙蒸水稀釋至0.55mg/mL,總RNA的濃度對除去rRNA是很重要的。把RNA溶液置於65℃水浴加熱5 分鐘,然後迅速插在冰上冷卻。
  2. 加入1/10體積5 mol/L NaCl使RNA溶液中鹽的濃度調至0.5 mol/L。

mRNA的分離[編輯]

mRNA與Oligo(dT)-纖維素結合[編輯]

用移液器重新懸浮oligo(dT)-纖維素,按下表取適量的oligo(dT)-纖維素到RNA樣品中,蓋上蓋子,顛倒數次將oligo(dT)-纖維素與RNA混勻。於37℃水浴保溫並溫和搖盪15分鐘。

總RNA (mg) 寡聚Oligo(dT)-纖維素(mL) 洗滌緩衝液1,2 (mL) 洗脫體積(mL)
<0.2 0.2 1.0 1.0
0.2-0.5 0.5 1.5 1.5
0.5-1.0 1.0 3.0 3.0
1.0-2.0 2.0 5.0 5.0

轉移[編輯]

取1個5ml的一次性注射器,取適量經過高溫滅菌的玻璃棉塞緊前端,並把它固定在無RNase的支架上,再把oligo(dT)-纖維素/RNA懸浮液轉移到注射器,推進塞子直至底部,把含有未結合上的RNA液體排到無RNase的離心管中(保留至確定獲得足夠的mRNA)。

洗滌[編輯]

根據上表直接用注射器慢慢吸取適量的洗滌緩衝液1,溫和振盪,充分重新懸浮mRNA-oligo(dT)-纖維素,推進塞子,用無RNase的離心管收集洗出液。測定每一管的OD260,當洗出液中OD為0時準備洗脫。

洗脫[編輯]

根據上表直接用注射器慢慢吸取適量(2-3倍柱床體積)的洗脫緩衝液2或無RNase雙蒸水到注射器內充分重懸mRNA-oligo(dT)-纖維素,推進塞子以1/3至1/2柱床體積分管收集洗脫液。

測定[編輯]

測定每一管的OD260,合併含有RNA的洗脫液組分於4℃,2500g,離心2-3分鐘,上清轉移至新的離心管中,去掉殘餘的oligo(dT)-纖維素。

沉澱[編輯]

洗脫液中加入1/10體積的3mol/L NaAc (pH5.2), 再加入2.5倍體積的冰冷乙醇,混勻後,-20℃30分鐘或放置過夜。

離心收集[編輯]

12000g, 4℃離心15分鐘,小心棄去上清,mRNA沉澱此時往往看不見,用70%乙醇漂洗沉澱,12000g, 4℃離心5 分鐘,小心棄去上清液,沉澱空氣乾燥10分鐘,或真空乾燥10分鐘。將mRNA沉澱溶於適當體積的無RNase的雙蒸水,立即用於cDNA合成(或保存在70%乙醇中並貯存於-70℃)。

定量[編輯]

測定OD260和OD280,計算產率以及OD260/OD280的比率(同上一實驗)。

注意事項與提示[編輯]

  1. 整個操作過程必須嚴格遵守無RNase操作環境規則。
  2. 提取的總RNA必須完整,不能被降解,這是mRNA質量的先決條件。
  3. 總RNA與Oligo(dT)-纖維素的比例要適當,過量的總RNA,容易造成mRNA不純。
  4. RNA溶液與Oligo(dT)-纖維素結合前必須置於65℃加熱5 分鐘,這一步很重要,其作用
    • (1)破壞mRNA的二級結構,特別是poly(A+)尾處的二級結構,使poly(A+)尾充分暴露,提高poly(A+)RNA回收率;
    • (2)解離mRNA與rRNA的結合。加熱後應立即插入冰上,以免由於溫度的緩慢下降使mRNA又恢復其二級結構。
      mRNA變性瓊脂糖凝膠電泳示意圖(Lane 1, 0.24–7.5kb RNA分子量Maker; Lane 2, 老鼠肝臟總 RNA; Lane 3, 老鼠肝臟mRNA)
  5. 應注意mRNA不能被DNA污染,即使是1 ppm DNA污染,也可嚴重影響實驗結果。
  6. mRNA製備後,可用變性瓊脂糖凝膠電泳撿測其完整性和有無DNA污染。提取的mRNA應該在0.5~8.0kb之間呈現彌散狀,無明顯區帶,但大部分的mRNA應在1-2.0kb範圍內(如圖)。一般來說,經過一次純化分離的mRNA還會有微量的rRNA殘留,但一般來說不會對後續實驗造成很大的影響,如果樣品充足,可將經過一次純化分離的mRNA再純化一次,進一步提高其純度。
  7. 為防止mRNA降解,應避免多次凍融,可將mRNA少量分裝後保存。另外,如果有低溫冰箱,最好在 -70℃~ -80℃保存。 也可將mRNA在70%乙醇中-70℃保存一年以上。
  8. 寡聚(dT)纖維素柱用後可用0.3mol/l NaOH洗淨,然後用層析柱加樣緩衝液平衡,並加入0.02%疊氮鈉(NaN3)冰箱保存,重複使用。每次用前需用NaOH、滅菌 ddH2O、層析柱加樣緩衝液依次淋洗柱床。
  9. 一般而言,107哺乳動物培養細胞能提取1-5μg Poly(A+)RNA,約相當於上柱總RNA量的1%-2%。

實驗安排[編輯]

1. 第一天:試劑的配製和所用一次性塑料製品和玻璃器皿的去RNase處理(0.1%DEPC浸泡或高溫干烤)。

2. 第二天:進行(一)、(二)和(三)1-6。

3. 第三天:進行(三)7和變性瓊脂糖凝膠電泳撿測mRNA。

4. 為了避免由於保存時間過長造成的RNA降解,最好能將總RNA提取、mRNA的分離純化、RT-PCR和cDNA文庫構建實驗安排在連續的時間內進行。

引物的設計一般遵循的原則[編輯]

  1. 典型的引物20-24個核苷長。引物需要足夠長,保證序列獨特性,並降低序列存在於非目的序列位點的可能性。但是太長的引物可能會與錯誤配對序列雜交降低了特異性,同時因為 比短序列雜交慢,從而降低了產量。
  2. 設計5'端和中間區為G或C,且GC含量為50%~60%的引物,以增加引物的穩定性及其與目的序列雜交的穩定性。
  3. 3'末端儘量不要富含GC。設計引物時保證在最後5個核苷中含有3個A或T。但因為3'端核苷需要同模板退火以供聚合酶催化延伸,為了避免3'末端的錯誤配對,所以末端儘量避免為核苷A。
  4. 在引物對3'末端儘量避免互補序列以免形成引物二聚體,抑制擴增。如果引物序列可能產生內部二級結構會破壞引物退火穩定性,也要儘量避免。
  5. 此外,目的序列上並不存在的附加序列,如限制位點和啟動子序列,可以加入到引物5'端而不影響特異性。

有時候,僅有有限的序列信息可供用於引物設計。比如,如果僅知道胺基酸序列,可以設計簡併引物,同時使用較高的引物濃度(1μM到3μM),因為許多簡併混合物中的引物不是特異性針對目的模板。

為了增加特異性,可以參考密碼子使用表,根據不同生物的鹼基使用偏好,減少簡併性。次黃嘌呤可以同所有的鹼基配對,降低引物的退火溫度。不要在引物的3'端使用簡併鹼基,因為3'端最後3個鹼基的退火足以在錯誤位點起始PCR。