細胞凋亡檢測實驗（Annexin V/PI雙染色法）

細胞凋亡檢測可以：

用於腫瘤細胞和組織在內的不同種類病理標本研究；
應用於臨床診療，新藥研製、生物製品開發、腫瘤放化療、以及從促凋亡角度探索腫瘤的基因治療；
對相關疾病的早期發現、放化療的療效評價具有舉足輕重的地位。

實驗方法和原理

細胞凋亡早期改變發生在細胞膜表面，目前早期識別仍有困難。這些細胞膜表面的改變之一是磷脂醯絲氨酸（PS）從細胞膜內轉移到細胞膜外，使PS暴露在細胞膜外表面。PS是一種帶負電荷的磷脂，正常主要存在於細胞膜的內面，在細胞發生凋亡時細胞膜上的這種磷脂分佈的不對稱性被破壞而使PS暴露在細胞膜外。

Annexin V是一種Ca+依賴的磷脂結合蛋白，最初發現是一種具有很強的抗凝血特性的血管蛋白，Annexin V具有易於結合到磷脂類如PS的特性。對PS有高度的親和性。因此，該蛋白可充當一敏感的探針檢測暴露在細胞膜表面的PS。

PS轉移到細胞膜外不是凋亡所獨特的，也可發生在細胞壞死中。兩種細胞死亡方式間的差別是在凋亡的初始階段細胞膜是完好的，而細胞壞死在其早期階段細胞膜的完整性就破壞了。因此，可以建立一種用Annexin V結合在細胞膜表面作為凋亡的指示並結合一種染料排除試驗以檢測細胞膜的完整性的檢測方法。

實驗材料

細胞；

試劑與儀器

孵育緩衝液：10 mmol/L HEPES/NaOH，pH7.4，140 mmol/L NaCl，5 mmol/L CaCl2。
標記液：將FITC- Annexin V（寶靈曼公司產品）和PI加入到孵育緩衝液中，終濃度均為1 ug/ml。
流式細胞儀。

實驗步驟

1. 細胞收集：懸浮細胞直接收集到10 ml的離心管中，每樣本細胞數為（1~5）×106/mL 500~1 000 r/min離心5 min，棄去培養液。

2. 用孵育緩衝液洗滌1次，500~1 000 r/min離心5 min。

3. 用100 ul的標記溶液重懸細胞，室溫下避光孵育10~15 min。

4. 500~1 000 r/min離心5 min沉澱細胞孵育緩衝液洗1次。

5. 加入熒光（SA-FLOUS）溶液4℃下孵育20 min，避光並不時振動。

6. 流式細胞儀分析：流式細胞儀激發光波長用488 nm，用一波長為515 nm的通帶濾器檢測FITC熒光，另一波長大於560 nm的濾器檢測PI。

7. 結果判斷：凋亡細胞對所有用於細胞活性鑑定的染料如PI有抗染性，壞死細胞則不能。細胞膜有損傷的細胞的DNA可被PI着染產生紅色熒光，而細胞膜保持完好的細胞則不會有紅色熒光產生。因此，在細胞凋亡的早期PI不會着染而沒有紅色熒光信號。正常活細胞與此相似。在雙變量流式細胞儀的散點圖上，左下象限顯示活細胞，為（FITC-/PI-）；右上象限是非活細胞，即壞死細胞，為（FITC+/PI+）；而右下象限為凋亡細胞，顯現（FITC+/PI-）。