細胞周期測定實驗

細胞計數法

實驗方法原理體外培養細胞生長、分裂繁殖的能力，可用分裂指數來表示。它與生長曲線有一定的聯繫，如隨着分裂指數的不斷提高，細胞也就進入了指數生長期。

分裂指數指細胞群體中分裂細胞所佔的百分比，它是測定細胞周期的一個重要指標，也是不同實驗研究選擇細胞的重要依據。

一、實驗材料細胞

試劑、試劑盒胰酶甲醇培養液冰醋酸 Giemsa染液

儀器、耗材 CO2培養箱普通顯微鏡培養皿蓋玻片吸管

實驗步驟一、消化細胞，將細胞懸液接至內含蓋玻片的培養皿中。

二、CO2培養箱中培養48小時，使細胞長在蓋片上。

三、取出蓋片，按下列順序操作：

PBS漂洗3分鐘→甲醇：冰醋酸=3：1固定液中固定30分鐘→Giemsa液染色10分鐘→自來水沖洗。

四、蓋片晾乾後反扣在載玻片上，鏡檢。

五、計算

分裂指數=分裂細胞數/總細胞數×100%

注意事項 1. 操作時動作要輕，以免使蓋片上的細胞脫落。

Giemsa染液配製

稱Giemsa粉末0.5 g，加幾滴甘油研磨，再加入甘油（使加入的甘油總量為33 ml）。56℃中保溫90-120分鐘。加入33 ml甲醇，置棕色瓶中保存，此為Giemsa原液。使用時按要求用PBS稀釋。一般稀釋10倍。

BrdU參入法

實驗方法原理細胞周期指細胞一個世代所經歷的時間。從一次細胞分裂結束到下一次分裂結束為一個周期。細胞周期反應了細胞增殖速度。

單個細胞的周期測定可採用縮時攝影的方法，但它不能代表細胞群體的周期，故現多採用其他方法測群體周期。

BrdU（5-溴脫氧尿嘧啶核苷）加入培養基後，可做為細胞DNA複製的原料，經過兩個細胞周期後，細胞中兩條單鏈均含BrdU的DNA將佔l/2，反映在染色體上應表現為一條單體淺染。如經歷了三個周期，則染色體中約一半為兩條單體均淺染，另一半為一深一淺。細胞如果僅經歷了一個周期，則兩條單體均深染。計分裂相中各期比例，就可算出細胞周期的值。

實驗材料細胞

試劑、試劑盒 BrdU 甲醇冰醋酸 Giemsa染液秋水仙素 SSC 檸檬酸三鈉 NaCl

儀器、耗材冰箱玻片水浴鍋鍋蓋紫外燈光學顯微鏡

實驗步驟

一、試劑配製

1. BrdU配製

BrdU 10 mg加雙蒸水10 ml ，4℃下避光保存。

2. 2×SSC配製

NaCl 1.75 g，檸檬酸三鈉0.88 g，加水至100 ml，4℃保存。

二、細胞生長至指數期時，向培養液中加入BrdU，使最終濃度為10 μg/ml。

三、44小時加秋水仙素，使每ml中含0.1 μg。

四、48小時後常規消化細胞至離心管中，注意培養上清的漂浮細胞也要收集到離心管中。

五、常規染色體製片。

六、染色體玻片置56℃水浴鍋蓋上，鋪上2×SSC 液，距紫外燈管6 cm處紫外照射30分鐘。

七、棄去2×SSC液，流水沖洗。

八、Giemsa液染色10分鐘，流水沖洗，晾乾。

九、鏡檢100個分裂相，計第一、二、三、四細胞期分裂指數。

十、計算

細胞周期（Tc）=48/{（M1+2M2+3M3+4M4）/100}（小時）

細胞周期介紹

細胞周期（cell cycle)是指細胞從前一次分裂結束起到下一次分裂結束為止的活動過程，分為間期與分裂期兩個階段。

間期

間期又分為三期、即DNA合成前期（G1期）、DNA合成期（S期）與DNA合成後期（G2期）。

G1期　　

此期長短因細胞而異。體內大部分細胞在完成上一次分裂後，分化並執行各自功能，此G1期的早期階段特稱G0期。在G1期的晚期階段，細胞開始為下一次分裂合成DNA所需的前體物質、能量和酶類等。

S期　　

S期是細胞周期的關鍵時刻，DNA經過複製而含量增加一倍，使體細胞成為4倍體，每條染色質絲都轉變為由着絲點相連接的兩條染色質絲。與此同時，還合成組蛋白，進行中心粒複製。S期一般需幾個小時。

G2期　　

為分裂期做最後準備。中心粒已複製完畢，形成兩個中心體，還合成RNA和微管蛋白等。G2期比較恆定，需用1～1.5小時。

分裂期

細胞的有絲分裂（mitosis）需經前、中、後，末期，是一個連續變化過程，由一個母細胞分裂成為兩個子細胞。一般需1～2小時。

（1）.前期（prophase）染色質絲高度螺旋化，逐漸形成染色體（chromosome）。染色體短而粗，強嗜鹼性。兩個中心體向相反方向移動，在細胞中形成兩極；而後以中心粒隨體為起始點開始合成微管，形成紡錘體。隨着核仁相隨染色質的螺旋化，核仁逐漸消失。核被膜開始瓦解為離散的囊泡狀內質網。

（2）中期（metaphase）細胞變為球形，核仁與核被膜已完全消失。染色體均移到細胞的赤道平面，從紡錘體兩極發出的微管附着於每一個染色體的着絲點上。從中期細胞可分離得到完整的染色體群，共46個,其中44個為常染色體,2個為性染色體。男性的染色體組型為46，XY，女性為46,XX。分離的染色體呈短粗棒狀或髮夾狀，均由兩個染色單體借狹窄的着絲點連接構成。

（3）後期（anaphase）由於紡錘體微管的活動，着絲點縱裂，每一染色體的兩個染色單體分開，並向相反方向移動，接近各自的中心體，染色單體遂分為兩組。與此同時，細胞波拉長，並由於赤道部細胞膜下方環行微絲束的活動，該部縮窄，細胞遂呈啞鈴形。

（4）末期（telophase）染色單體逐漸解螺旋，重新出現染色質絲與核仁；內質網囊泡組合為核被膜；組胞赤道部縮窄加深，最後完全分裂為兩個2倍體的子細胞。

在體內根據細胞的分裂能力可把它們分為三類：

①增殖細胞群，如造血幹細胞，表皮與胃腸粘膜上皮的幹細胞。這類細胞始終保持活躍的分裂能力，連續進入細胞周期循環。

②不再增殖細胞群，如成熟的紅細胞、神經細胞、心肌細胞等高度分化的細胞，它們喪失了分裂能力，又稱終末細胞（end cell）。

③暫不增殖細胞群，如肝細胞、腎小管上皮細胞、甲狀腺濾泡上皮細胞。它們是分化的，並執行特定功能的細胞，在通常情況下處於G0期，故又稱G0期細胞。在某種刺激下，這些細胞重新進入細胞周期。如肝部分切除術後，剩餘的肝細胞迅速分裂。

流式細胞儀

實驗方法原理流式細胞儀的工作原理是將待測細胞放入樣品管中，在氣體的壓力下進入充滿鞘液的流動室。在鞘液的約束下細胞排成單列由流動室的噴嘴噴出，形成細胞柱。通過對流動液體中排列成單列的細胞進行逐個檢測，得到該細胞的光散射和熒光指標，分析出其體積、內部結構、DNA、RNA、蛋白質、抗原等物理及化學特徵。

細胞內的DNA含量隨細胞周期進程發生周期性變化，如G0/G1期的DNA含量為2C，而G2期的DNA含量是4C。利用PI標記的方法，通過流式細胞儀對細胞內DNA的相對含量進行測定，可分析細胞周期各時相的百分比。

一、實驗材料 HeLa細胞

試劑、試劑盒乙醇 RNase-A PI PBS

儀器、耗材流式細胞儀細胞培養設備離心機水浴冰箱注射器離心管封口膜微量移液器

實驗步驟一、取對數生長期細胞，倒去培養液，胰酶適度消化細胞，用培養液吹打，800 rpm，離心 15 min去上清。

二、PBS洗2次，加0.5 mL PBS吹勻，務必吹散。

三、用5 mL注射器將細胞吸起，用力打入5 mL 70%(預冷)乙醇中，封口膜封口。4℃固定過夜（可長至2周）。

四、800 rpm 15 min收集固定細胞，PBS洗2次。

五、用0.4 mL PBS重懸細胞並轉至Tube中輕輕吹打（防止細胞破碎）。

六、加RNase-A約3 μL至終濃度約為50 μg/mL ，37℃水浴消化30 min；

七、加PI約50 μL至終濃度約為65 μg/mL ，在冰浴中避光染色30 min。

八、用300目（孔徑40~50微米）尼龍網過濾，上機檢測。

樣品分析測定及打印。

常見問題

1. Q：要做胃粘膜組織的DNA含量及倍體檢查，但取材後要等幾個星期才會做流式細胞術檢查，請問：胃組織要怎樣保存好呢？用低溫保存，還是用乙醇固定？或者固定後再低溫下保存？

A：我做過乳腺細胞的DNA含量測定，取得組織以後，先處理成單細胞懸液，然後再加70%冰乙醇固定，要保證冰乙醇的最終濃度為50%，這樣固定的細胞懸液可以至少保存12小時，最多可保存一個月，上機檢測前再加PI綜合染液。我就是這樣做的，保存了將近三個星期，結果還可以，變異系數為5%.

2. 實驗中想用PI分析細胞周期及凋亡率，請教幾個問題：

Q：（1）所用的RNAs酶用什麼配製呢？用PBS配嗎？

A：RNaseA用PBS配製沒有問題，但是注意要沸水浴去除DNase的活性。

Q：（2）測細胞周期和凋亡率時都要用RNAs酶，可以一起檢測嗎？

A：用流式細胞儀測定時細胞周期和凋亡率是同時測定的，不用擔心。

Q：（3）Triton－x－100是固定劑吧，用了70％的冷乙醇（是4℃嗎？），是不是就不用Triton－x－100固定了？

A：Triton X-100是起透化作用的，不是固定劑，可以用75％的乙醇於-20度固定。

Q：（4）還要設什麼內參標準（5％雞紅細胞）嗎？

A：對照肯定是需要的，這個根據自己的需要進行設置。

Q：（5）不用試劑盒行不行啊？

A：完全可以不用試劑盒。

以下提供一個自己的實驗步驟供參考：

（1）200×g離心10min收集細胞；

（2）棄去上清，PBS漂洗一次，將細胞重懸於預冷的80%乙醇中，-20°C固定24h以上；

（3）進行流式細胞儀檢測前，200×g離心10min收集固定後的細胞；

（4）PBS洗滌一次，200×g離心10min收集細胞；

（5）將細胞重懸於含100ug/ml RNase A和50ug/ml PI的PBS中，室溫孵育30min；

（6）將經PI染色和RNase A消化後的細胞懸液用300目的尼龍膜過濾後即可利用流式細胞儀進行細胞周期分佈和凋亡細胞定量的分析。

3. Q：流式檢測細胞周期時加RNA酶所需的溫度？

A：其實有關RNA酶在凋亡檢測制樣過程中使用的必要性問題尚有人持不同意見，該觀點的人認為RNA酶在環境中無所不在，常規制樣過程中所接觸的試劑和環境中的RNA酶已足以降解樣品中的RNA，所以為了簡便實驗操作，也有人不加RNA酶或如你所參考的方法將其與PI染液一起使用。不過經典的方法還是「先加RNA酶37度孵育30min，然後加PI 4度孵育30min」。

至於染色時使用4度，是因為低溫可減弱分子運動，增強熒光染料結合的穩定性和減少可能的熒光損耗。上流式前細胞用75％乙醇固定行嗎？

4. Q：我養腫瘤細胞，測周期。看到帖子說70％乙醇必須用PBS和乙醇配，用水配細胞會碎裂，有帖子說PBS和乙醇配會出現絮狀物。上流式前細胞用75％乙醇固定，就用買來的現成的瓶裝75％乙醇，行嗎？必須那麼嚴格嗎？

A：先用冷PBS懸浮細胞，大約1-2ml，充分懸浮，使細胞充分分散成單細胞。之後緩慢加入無水乙醇，終濃度為70-75%乙醇。不直接加75%乙醇的原因是：直接加入乙醇會導致細胞團聚的現象，很難重懸成單細胞。乙醇固定之後沒有細胞沉澱。

5. Q：我要做流式分析細胞周期，我大概收集了10的6次方細胞，但細胞在乙醇固定之後，還看到有細胞沉澱的，但PBS洗滌兩次之後，就基本沒什麼細胞沉澱了，上機發現就發現不了細胞了。這是怎麼回事啊？怎麼解決這個問題啊？

A：很可能是洗細胞的過程中丟失了，解決辦法有：

（1）儘量採用尖底的離心管和水平離心機

（2）離心後儘量用吸管吸取上清，不要傾倒；吸上清時最好殘留1mm左右的水膜，不要吸完。

（3）離心的轉速或時間可稍微增加一點兒

（4）每次加抗體時，吸頭最好不要接觸液面；混勻時最好不要用吸頭吹打，以免吸頭掛壁帶走部分細胞。