細胞生物學/B淋巴細胞分離技術

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B淋巴細胞分離技術[編輯]

實驗原理[編輯]

膜表面免疫球蛋白(SmIg),是B細胞特有的表面標誌,它既是B細胞識別抗原的受體,與相應抗原特異性結合;又是表面抗原,能與相應的抗Ig的抗體結合,故可用熒光標記的抗Ig抗體作免疫熒光鏡檢,以查出B淋巴細胞。由於B淋巴細胞在分化過程中最先出現SmIg,所以該法可以檢出全部B淋巴細胞。B淋巴細胞表面最先出現IgM,以後相繼出現IgG、IgD、IgA等表面免疫球蛋白。而金黃色葡萄球菌A蛋白(SPA)能與許多哺乳動物IgG的Fc段發生結合,並且這種反應也發生於膜表面的IgG,所以亦可以用熒光標記的SPA菌體(FITCSPA)替代FITC抗IgG檢測SmIg陽性B淋巴細胞,凡於FITCSPA結合的細胞,在熒光顯微鏡下,可見到B淋巴細胞表面或周圍佈滿許多呈黃綠色熒光的菌體,即為SmIg陽性細胞即為B淋巴細胞。現將熒光標記SPA法介紹如下:

實驗材料[編輯]

1 凍干熒光金黃色葡萄球菌A蛋白(FITCSPA)菌體試劑,用時按要求稀釋。

2 pH值72 Hanks液,含5%小牛血清。

3 淋巴細胞分層液,20℃時比重為1077±0002

4吸管、移液管、台式離心機、載玻片、蓋玻片

實驗步驟[編輯]

1、取肝素抗凝血2ml,用Hanks液稀釋1~2倍,輕輕加入到裝有3ml淋巴細胞分層液的試管中,2000~2500 r/min水平離心20~25min,獲取淋巴細胞。

2、用pH值7.2Hanks液洗2次,最終配成細胞數為2~25×106/ml的淋巴細胞懸液。用pH值72Hanks液稀釋FITCSPA菌體試劑,然後將淋巴細胞液與等量的FITCSPA菌體懸液混合,充分混勻後,放4℃冰箱30min。

3、再用經37℃預熱的Hanks液(含5%小牛血清)洗滌離心

4、取沉澱細胞滴加在載玻片上,覆以蓋玻片,在熒光顯微鏡下觀察。

結果觀察[編輯]

凡淋巴細胞表面粘附5個以上菌體細胞為SmIg陽性。一般先用暗視野計算熒光陽性細胞數,繼用明視野計算同一視野中淋巴細胞總數。每份標本至少計算200個淋巴細胞,並求出熒光陽性細胞百分率,同時按原血標本中淋巴細胞的總數計算B淋巴細胞的絕對值。同時,每個B淋巴細胞表面可帶有不同類別的Ig,即IgM、IgG、IgA等,如果分別用單價熒光抗Ig血清染色,則可鑑定不同Ig的B淋巴細胞。但淋巴細胞數量的多少會影響檢出率。過多或過少時,除難以計數外,染色背景明暗不勻,着色與不着色的細胞難以區別,一般以2~25×106/ml細胞濃度為宜,活細胞數應不少於95%。

實驗分析[編輯]

此法特異性強,熒光亮度好,操作迅速簡便。加上試劑有商品供應,可以使本法標準化。

一般SmIg陽性的B淋巴細胞表面或周圍均可佈滿許多黃綠色熒光菌體,很少見到表面只粘附2~3個菌體細胞同時,每個B淋巴細胞表面可帶有不同類別的Ig,即IgM、IgG、IgA等,如果分別用單價熒光抗Ig血清染色,則可鑑定不同Ig的B淋巴細胞。

淋巴細胞數量的多少會影響檢出率。過多或過少時,除難以計數外,染色背景明暗不勻,着色與不着色的細胞難以區別,一般以2~25×106/ml細胞濃度為宜,活細胞數應不少於95%。

實驗注意事項[編輯]

當SmIg抗體發生結合時,由於抗血清為雙價,使SmIg出現交聯現象,這種抗原與抗體結合物可連成斑點和帽狀,時間過長,帽狀結合物可脫落或被吞飲而消失,因此染色後,觀察時間不能超過30min,或在染色時加疊氮鈉防止帽狀物形成或被吞飲。

在滴片前要徹底去除游離的抗體,以避免假陽性結果

備註[編輯]

異硫氰酸熒光素 (fluorescein isothiocyanate, FITC) FITC純品為黃色或橙黃色結晶粉末,易溶於水和酒精溶劑。有兩種異構體,其中異構體Ⅰ型在效率、穩定性與蛋白質結合力等方面都更優良。FITC分子量為389.4,最大吸收光波長為490~495nm,最大發射光波長為520~530nm,呈現明亮的黃綠色熒光。FITC在冷暗乾燥處可保存多年,是目前應用最廣泛的熒光素。其主要優點是人眼對黃綠色較為敏感,通常切片標本中的綠色熒光少於紅色。