B淋巴細胞分離技術

實驗原理

膜表面免疫球蛋白(SmIg)，是B細胞特有的表面標誌，它既是B細胞識別抗原的受體，與相應抗原特異性結合；又是表面抗原，能與相應的抗Ig的抗體結合，故可用熒光標記的抗Ig抗體作免疫熒光鏡檢，以查出B淋巴細胞。由於B淋巴細胞在分化過程中最先出現SmIg，所以該法可以檢出全部B淋巴細胞。B淋巴細胞表面最先出現IgM，以後相繼出現IgG、IgD、IgA等表面免疫球蛋白。而金黃色葡萄球菌A蛋白(SPA)能與許多哺乳動物IgG的Fc段發生結合，並且這種反應也發生於膜表面的IgG，所以亦可以用熒光標記的SPA菌體(FITCSPA)替代FITC抗IgG檢測SmIg陽性B淋巴細胞，凡於FITCSPA結合的細胞，在熒光顯微鏡下，可見到B淋巴細胞表面或周圍佈滿許多呈黃綠色熒光的菌體，即為SmIg陽性細胞即為B淋巴細胞。現將熒光標記SPA法介紹如下：

實驗材料

1 凍干熒光金黃色葡萄球菌A蛋白(FITCSPA)菌體試劑，用時按要求稀釋。

2 pH值72 Hanks液，含5%小牛血清。

3 淋巴細胞分層液，20℃時比重為1077±0002

4吸管、移液管、台式離心機、載玻片、蓋玻片

實驗步驟

1、取肝素抗凝血2ml，用Hanks液稀釋1～2倍，輕輕加入到裝有3ml淋巴細胞分層液的試管中，2000～2500 r/min水平離心20～25min，獲取淋巴細胞。

2、用pH值7.2Hanks液洗2次，最終配成細胞數為2～25×106/ml的淋巴細胞懸液。用pH值72Hanks液稀釋FITCSPA菌體試劑，然後將淋巴細胞液與等量的FITCSPA菌體懸液混合，充分混勻後，放4℃冰箱30min。

3、再用經37℃預熱的Hanks液(含5%小牛血清)洗滌離心

4、取沉澱細胞滴加在載玻片上，覆以蓋玻片，在熒光顯微鏡下觀察。

結果觀察

凡淋巴細胞表面粘附5個以上菌體細胞為SmIg陽性。一般先用暗視野計算熒光陽性細胞數，繼用明視野計算同一視野中淋巴細胞總數。每份標本至少計算200個淋巴細胞，並求出熒光陽性細胞百分率，同時按原血標本中淋巴細胞的總數計算B淋巴細胞的絕對值。同時，每個B淋巴細胞表面可帶有不同類別的Ig，即IgM、IgG、IgA等，如果分別用單價熒光抗Ig血清染色，則可鑑定不同Ig的B淋巴細胞。但淋巴細胞數量的多少會影響檢出率。過多或過少時，除難以計數外，染色背景明暗不勻，着色與不着色的細胞難以區別，一般以2～25×106/ml細胞濃度為宜，活細胞數應不少於95%。

實驗分析

此法特異性強，熒光亮度好，操作迅速簡便。加上試劑有商品供應，可以使本法標準化。

一般SmIg陽性的B淋巴細胞表面或周圍均可佈滿許多黃綠色熒光菌體，很少見到表面只粘附2～3個菌體細胞同時，每個B淋巴細胞表面可帶有不同類別的Ig，即IgM、IgG、IgA等，如果分別用單價熒光抗Ig血清染色，則可鑑定不同Ig的B淋巴細胞。

淋巴細胞數量的多少會影響檢出率。過多或過少時，除難以計數外，染色背景明暗不勻，着色與不着色的細胞難以區別，一般以2～25×106/ml細胞濃度為宜，活細胞數應不少於95%。

實驗注意事項

當SmIg抗體發生結合時，由於抗血清為雙價，使SmIg出現交聯現象，這種抗原與抗體結合物可連成斑點和帽狀，時間過長，帽狀結合物可脫落或被吞飲而消失，因此染色後，觀察時間不能超過30min，或在染色時加疊氮鈉防止帽狀物形成或被吞飲。

在滴片前要徹底去除游離的抗體，以避免假陽性結果

備註

異硫氰酸熒光素 (fluorescein isothiocyanate, FITC) FITC純品為黃色或橙黃色結晶粉末，易溶於水和酒精溶劑。有兩種異構體，其中異構體Ⅰ型在效率、穩定性與蛋白質結合力等方面都更優良。FITC分子量為389.4，最大吸收光波長為490～495nm，最大發射光波長為520～530nm，呈現明亮的黃綠色熒光。FITC在冷暗乾燥處可保存多年，是目前應用最廣泛的熒光素。其主要優點是人眼對黃綠色較為敏感，通常切片標本中的綠色熒光少於紅色。