生物化学与分子生物学/DNA实验技术/单核苷酸多态性（SNP）实验

SNP (Single Nucleotide Polymorphism)即单核苷酸多态性，是由于单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态性(Polymorphism)。据估计，在人类基因组中，大约每千个碱基中有一个SNP，无论是比较于度多态性(RFLP)分析还是微卫星标记(STR)，都要广泛得多。

实验方法原理

SNP (Single Nucleotide Polymorphism)即单核苷酸多态性，是由于单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态性(Polymorphism)。据估计，在人类基因组中，大约每千个碱基中有一个SNP，无论是比较于限制性片段长度多态性(RFLP)分析还是微卫星标记(STR)，都要广泛得多。SNP是我们考察遗传变异的最小单位,据估计，人类的所有群体中大约存在一千万个SNP位点。一般认为，相邻的SNPs倾向于一起遗传给后代。于是，我们把位于染色体上某一区域的一组相关联的SNP等位位点称作单体型（haplotype）。大多数染色体区域只有少数几个常见的单体型（每个具有至少5%的频率），它们代表了一个群体中人与人之间的大部分多态性。一个染色体区域可以有很多SNP位点，但是我们一旦掌握了这个区域的单体型，就可以只使用少数几个标签SNPs(tagSNP)来进行基因分型，获取大部分的遗传多态模式。

实验材料

组织样品
试剂、试剂盒：液氮、PBS、GA缓冲液、GB缓冲液、蛋白酶K、无水乙醇、蛋白液、漂洗液等
仪器、耗材：离心管、离心机、废液收集管、吸附柱、水浴锅、分光光度计、低温冰箱等

实验步骤

DNA抽提

取新鲜肌肉组织约100 mg，PBS漂洗干净，置于1.5 ml离心管中，加入液氮，迅速磨碎。
加200 μl 缓冲液GA，震荡至彻底悬浮。加入20 μl 蛋白酶K（20 mg/ml）溶液，混匀。
加220 μl 缓冲液GB，充分混匀，37℃消化过夜，溶液变清亮。加220 μl 无水乙醇，充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。
将上述一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB 中，（吸附柱放入废液收集管中）12 000 rpm 离心30 秒，弃掉废液。
加入500 μl 去蛋白液GD（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12 000 rpm 离心30 秒，弃掉废液。
加入700 μl 漂洗液GW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12 000 rpm离心30 秒，弃掉废液。加入500 μl 漂洗液GW，12 000 rpm 离心30 秒，弃掉废液。将吸附柱CB 放回废液收集管中，12 000 rpm 离心2 分钟，尽量除去漂洗液。
将吸附柱CB 转入一个干净的离心管中，加入100 μl 洗脱缓冲液（洗脱缓冲液应在60-70℃水浴预热），混匀，室温放置15 分钟，12 000 rpm 离心30 秒。洗脱第二次，将洗脱缓冲液50 μl 加入吸附柱中，室温放置15 分钟，12 000 rpm 离心30 秒。
采用Beckman DU 640 spectrophotometer 检测提取到的基因组DNA 浓度，在OD260 处有显著吸收峰。同时检测纯度，OD260/280 的值应为为1.7-1.9。
从原液中取出相应体积DNA 溶液，稀释致50 ng/ul，原液置于-70℃保存，稀释液置于-20℃保存。

PCR扩增目的片段

按相关的试剂说明在标准反应管中准备反应体系，典型的PCR反应体系如下（20 ul体系）
向左扳动仪器盖子上的手柄，揭开仪器盖子，小心放置样品管于仪器的相应样品孔中，轻轻盖上盖子，将顶部的旋钮慢慢旋紧，让热盖紧密接触样品管，样品放置完毕。

PCR反应体系
10x Buffer	2 μl
Taq酶	1 μl
dNTP	0.5 μl
上游引物	0.5 μl
下游引物	0.5 μl
无菌水	14.5 μl
DNA模版	1 μl

在T1型PCR仪上编辑一个程序

1. 按[C programs]进入编辑模式。要在主目录中创建一个程序请按[D enter]。要进入一个子目录，用→键将光标向右移动，然后用↑↓键选择一个子目录。按[D enter]进入选择的子目录。

2. 输入程序中要求的温度：用[D enter]确认温度。为其输入时间，用小数点来间隔。顺序为h.m.s。用[D enter]确认时间设置，或者用光标键移动到下一个区域。＃表示循环的次数。设定循环值=总循环值-1，即，总循环数为30时应输入“29”。用[C pgm ok]来储存一个完整的程序。程序数据永久的储存在记忆中。

四、运行程序

按[B start/stop]选择一个程序。用→↑↓键选择一个子目录，或者用[D enter]进入主目录。输入您想要启动的程序的号码。或者，按[A list]在该子目录中的所有程序的列表中选择一个程序。用↑↓键在列表中滚动选择。用[D enter]确认用强光突出的程序。按[D start]启动程序。

五、控制测试过程

运行过程中，按A按钮，可以获得程序剩余的时间信息。运行完成后，按STOP按钮终止实验，按YES确认终止。小心旋开热盖，按照放置样品的操作顺序，打开盖子，取出实验样品，再盖上盖子，关闭电源，本次实验结束。

六、PCR产物测序

由专门负责测序的服务公司完成。

七、数据分析

少量可人工读取，大量可软件读取。比对发现的SNP在基因组中的位置：重点是启动子区、外显子区域（包括编码区的cSNP及5’及3’UTR）、剪切边界等，密码子的改变是否导致氨基酸的改变：错义突变、无义突变、终止突变。

注意事项

为保证待测目的区域测序真实可靠，引物设计应该使待测目的区域边界距离上下游引物至少各50 bp；
引物设计建议使用在线方式，以保证成功率；
为保证测序敏感性，PCR产物片段大小应在250 bp－650 bp范围；
为方便实验，建议引物合成时分装成1 o.d/管，方便将PCR与测序的引物分开；
为保证引物的特异性，建议引物设计后在NCBI上blast确认；
为防止降解，PCR产物应尽快测序，否则应该保存在-20℃，且时间不宜过长；
为保证结果真实性，建议对关键点进行反向测序确认。