生物化學與分子生物學/其他實驗技術/大腸桿菌轉化實驗

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大腸桿菌轉化可以

  1. 將重組DNA分子導入大腸桿菌受體細胞進行複製,增殖和表達,以獲得目的基因;
  2. 驗證大腸桿菌感受態細胞效果;
  3. 用於分子生物學其他研究。

原理[編輯]

質體DNA粘附在細菌細胞表面,經過42°C短時間的熱擊處理,促進吸收DNA.然後在非選擇培養基中培養一代,待質體上所帶的抗菌素基因表達,就可以在含抗菌素的培養基中生長。

器材[編輯]

旋渦混合器,微量移液取樣器,移液器吸頭,1.5ml 微量離心管,雙面微量離心管架,乾式恆溫氣浴(或恆溫水浴鍋),製冰機,恆溫搖床,培養皿(已鋪好固體LB-Amp),超淨工作檯,酒精燈,玻璃塗棒,恆溫培養箱。

材料和試劑[編輯]

質體DNA,重組DNA,培養基(不加抗菌素),LB培養基(加抗菌素),無菌ddH2O,IPTG,X-gal。

實驗準備[編輯]

無菌ddH2O,1.5ml離心管裝入鋁製飯盒(滅菌)、移液器吸頭裝入相應的吸頭盒(滅菌),20%IPTG(M/V),2% X-gal(M/V,用N,N-二甲基甲醯胺配)。

操作步驟[編輯]

  1. 事先將恆溫水浴的溫度調到42℃。
  2. 從-70℃ 超低溫冰櫃中取出一管(100μl)感受態菌,立即用手指加溫融化後插入冰上,冰浴5~10min。
  3. 加入5μl連接好的質體混合液(DNA含量不超過100ng),輕輕震盪後放置冰上20min。
  4. 輕輕搖勻後插入42℃水浴中1~2min進行熱休克,然後迅速放回冰中,靜置3~5min。
  5. 在超淨工作檯中向上述各管中分別加入500μl LB培養基(不含抗菌素)輕輕混勻,然後固定到搖床的彈簧架上37℃震盪1h.
  6. 在超淨工作檯中取上述轉化混合液100~300μl,分別滴到含合適抗菌素的固體LB平板培養皿中,用酒精燈燒過的玻璃塗布棒塗布均勻(注意:玻璃塗布棒上的酒精熄滅後稍等片刻,待其冷卻後再塗)。
  7. 如果載體和宿主菌適合藍白斑篩選的話,滴完菌液後再在平板上滴加40μl 2% X-gal,8μl 20% IPTG,用酒精燈燒過的玻璃塗布棒塗布均勻。
  8. 在塗好的培養皿上做上標記,先放置在37℃恆溫培養箱中30-60min直到表面的液體都滲透到培養基里後,再倒置過來放入37℃恆溫培養箱過夜。
  9. 在被細菌污染的桌面上噴灑70%乙醇,擦乾桌面,寫實驗報告。
  10. 觀察平板上長出的菌落克隆,以菌落之間能互相分開為好。注意白色菌斑。