生物化學與分子生物學/其他實驗技術/感受態細胞製備及轉化實驗

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大腸桿菌感受態細胞的製備[編輯]

體外連接的 DNA 重組分子導入合適的受體細胞才能大量增殖。野生型 E.coli並不容易轉化,這是由於細菌產生一種酶能迅速降解進入的外源DNA。為了提高受體菌攝取外源DNA 的能力,提高轉化效率以獲得更多的轉化子,人們摸索出不同的方法處理細菌,經過多年的努力,科學家們發現了可以增加細胞吸收外源DNA效率的方法,那就是用化學方法處理細胞,使其改變膜對DNA 的通透性。這種經過理化方法誘導細胞,使其處於最適攝取和容納外來DNA 的生理狀態,該細胞就稱為感受態細胞,即細胞處於能攝入核酸分子時的生理狀態。這種方法已經成為基因工程的常規技術,它對於我們利用體外DNA 重組技術來了解真核和原核生物的基因功能特別重要。細菌的轉化有兩種類型:一種是自然轉化(natural transformation),在自然轉化中細菌可以自由地吸收DNA,通過它來進行遺傳轉化;另一種是工程轉化(engineered transformation),在這種轉化中,細菌發生改變使得它們能攝入並轉化外源 DNA。枯草桿菌中的轉化屬於自然轉化,E.coli 轉化就屬於工程轉化。

對於E.coli,目前主要採用電轉化法和CaCl 法將外源DNA 導入受體細胞中,並需要相應地製備電轉化感受態細胞和CaCl 感受態細胞。其中,電轉化法是利用瞬間高壓在細胞上打孔,因而需用冰冷的超純水多次洗滌處於對數生長前期的細胞,以使細胞懸浮液中應含有儘量少的導電離子。其轉化效率為10 ~10 轉化子

/μg DNA。而對於熱激法,是利用冰冷的CaCl 處理對數生長期的細胞,可以誘導其產生短暫的「感受態」,易於攝取外源 DNA。轉化效率為 10 ~10 轉化子/μg DNA。

CaCl 感受態細胞的製備[編輯]

CaCl 感受態細胞的製備實驗步驟[編輯]

1.前夜接種受體菌(DH5α 或DH10B),挑取單菌落於LB培養基中37℃搖床培養過夜(約16小時);

2.取1ml 過夜培養物轉接於100ml LB 培養基中,在37℃搖床上劇烈振盪培養約2.5-3 小時(250-300rpm);

3.將0.1M CaCl 溶液置於冰上預冷;

以下步驟需在超淨工作檯和冰上操作

4.吸取1.5ml 培養好的菌液至1.5ml 離心管中,在冰上冷卻10 分鐘;

5.4℃下3000 g 冷凍離心5分鐘;

6.棄去上清,加入 100μl 預冷 0.1M CaCl 溶液,用移液槍輕輕上下吸動打勻,使細胞重新懸浮,在冰放置20 分鐘;

7.4℃下3000 g 冷凍離心5 分鐘;

8.棄去上清,加入100μl 預冷0.1M CaCl 溶液,用移液槍輕輕上下吸動打勻,使細胞重新懸浮;

9.細胞懸浮液可立即用於轉化實驗或添加冷凍保護劑(15% - 20%甘油)後超低溫冷凍貯存備用(-70℃)。

以上是基本步驟,基本同「分子克隆指南」,具體的體積(一次製作感受態細胞的量)由個人根據實際情況掌握,不一定要死守以上的體積,但要保持試劑、

菌體等量的平衡。提高感受態效率的關鍵如下述――

注意事項[編輯]

  1. 克隆的新鮮程度,一定要選新鮮平板的單克隆,即剛塗布生長過夜的平板;
  2. 菌體的OD 值,JM109 或BL21,OD值為0.35,DH5α為0.4,要儘量保證OD600值不要過高,更不能超過0.6;
  3. 低溫處理的時間,做完後冰上保存12 到24h後分裝,並保存於-80℃;
  4. 試劑和用品,非如果有可能,所有的用品(離心管、搖瓶等等)用新的,如果使用舊的,要確保乾淨,CaCl 溶液要過濾除菌,不要高壓滅菌。

電轉感受態細胞的製備[編輯]

  1. -80℃冰箱保存的菌種在SOB 固體平板上劃單菌落;
  2. 次晨,挑選單克隆感至內含1ml SOB 液體培養基的試管中,37℃,300rpm,6 hr;
  3. 然後轉接到含400ml SOB 液體培養基的2L 搖瓶中(按1:500 的量轉接),300rpm,4hr,然後每隔2 min 測一次OD ,至OD =0.76;
  4. 立刻置冰水浴中驟冷,可以選擇在一個大的裝有冰水混合物的容器里快速旋轉搖動內有培養物的三角瓶,儘快使培養物溫度降下來;
  5. 隨後在250ml 預冷的離心杯中離心,4℃,2000 g,10 min;
  6. 棄上清後,用預冷的水(滅菌的重蒸水)洗:先加少量水懸浮菌體(具體辦法:在一個大的裝有冰水混合物的容器里旋轉搖動離心杯使菌體懸浮),菌體懸浮後再把水加滿,2200 g,10 min,棄上清;
  7. 再用10%的甘油同樣方法洗兩次,2400 g,10 min;
  8. 最後一次倒盡甘油後(儘量去乾淨),用殘存在管底的甘油懸浮細胞,每 120μl 分裝到1.5 mL Ep 管(EP 管要-70 度預冷),用-70℃的乙醇迅速冰凍;
  9. 保存在-80℃冰箱中備用。

以 DH10B 為例說明[編輯]

步驟 1:每次做感受態都要新鮮劃菌,不要使用保存於 4℃或室溫的平板;儘量使用原代菌,最好不要用多次傳代的菌;LB 平板也可以,但效率可能會降低;SOB 使用 GIBCO 公司的試劑配製,效果最好;但若電轉的連接子為一般性載體,使用普通的試劑配製培養基即可;

步驟 2:該步驟與步驟 3 中出現的數字存在相關性,條件允許的話儘量按照要求做,不允許的話則按照實驗室實際情況稍做修改,確保菌體生長良好;

步驟 3:確保 OD 達到要求,寧可低一點,也不要高一點,建議在達到 0.5 後過 2-3min 就測一次 OD 值;

步驟 4:一定要在冰水混合物中快速旋轉搖動內有培養物的三角瓶,儘快使培養物溫度降下來,不要靜置於冰水混合物中,搖動大約 10 min;

步驟 5:建議使用離心杯,因為其底是平的,並且滅菌時裡面要裝上雙蒸水,利於

步驟 6,7 與 8 中的懸浮操作;

步驟 6:懸浮菌體時不要使用移液槍,開始時加入的水量要少,避免過多,等菌體重懸起來以後再加滿。用手搖動時保證培養基液面低於冰面,重懸過程中注意懸浮的菌團出現,需將其全部分散開;

步驟 7:同上

步驟 8:儘量倒盡甘油,使感受態更濃,每 400ml 培養物製備 1-1.5mL 感受態為益;

關於 EP 管預冷與-70℃的乙醇迅速冰凍的具體辦法:在菌種保藏盒內加入適量的乙醇,再把空的 EP 管蓋上帽子後放入其中,置於-70 度冰箱(或-80℃冰箱)預冷,分裝感受態的時候將其取出(連帶保藏盒),在超淨台分裝,分裝時使用滅菌並剪去尖頭的槍頭,儘量使用 1ml 藍色大槍頭。完成後置於- 80℃冰箱;

步驟 9:關於保存感受態的溫度,- 70℃、- 80℃皆可,建議實驗室現有的溫度最低的冰箱;

以上方法適用於很多 E.coli 菌株,例如:XL1-Blue,DH10B,DH5α,Top10,JM109,BL21 等做電轉感受態,可能不同的菌株生長速度有差異,方案中的培養

時間與最佳 OD 值可能有變化,不妨用此方案嘗試一下,如果效率不夠高的話可以對所用的菌株進一步進行優化。

注意[編輯]

  1. 所用的搖瓶和離心管要洗的特別乾淨,禁用任何洗滌劑,用 NaOH 溶液洗數次;
  2. 重懸菌體用手振盪,不用振盪器;
  3. 用槍吸打要輕,槍頭需要剪去尖頭;
  4. 如果做的效果好,效率可以達到 10 以上。

對於 E.coli 感受態製備,以上實驗方案都要特別注意:所有的容器要用新的,不用洗滌劑,用手洗且保證徹底乾淨;相應的器材要作為製備感受態細胞專用,不做其他用途;試劑要選用最好的,儘量過濾除菌,不用高壓滅菌等等。因為電轉化效率更高,對要求轉化率的實驗,建議採用電轉化的方法。

附 1. 高效感受態細胞製作方法:[編輯]

方法一[編輯]

A 液:1M,MnCl :

B 液:1M,HEPES,pH=6.2-6.8,用無菌水配,配後不需滅菌;

C 液 稱取 CaCl 0.10g,KCl 1.18g,全部轉入細口試劑瓶,然後加入 46ml 三蒸水,輕輕振盪使所有組分充分溶解。將瓶塞蓋上並用牛皮紙、棉線包紮,然後放入滅菌鍋 121℃高壓滅菌備用。

取 1 管 B 液(0.6ml),全部加入 C 液(46ml)中,混勻後,再用 1ml 移液器加入 3.3ml A 液,混勻冰浴即可使用。

劃線得到單菌落,37℃培養箱培養約 17 小時, 挑取 2-4 個形態飽滿的單菌落接種於裝有 100ml SOB 培養基的三角瓶,37℃劇烈振盪(300 rpms)培養 3-4 小時, 將培養溫度調至 18℃劇烈振盪(3280 rpms)培養,其餘與普通感受態差不多,每管加入 4ml TB 緩衝液,輕輕振盪,使菌體重新懸浮,加入 280ml DMSO(可用國產分析純),混勻後分裝入 1.5ml EP 管,冰上靜置 15 分鐘。用紗布將所有裝有感受態的 EP 管包好,用棉線系好後放入液氮中速凍,在液氮中靜置 12 小時以上。

取出感受態放入-70℃超低溫冰箱備用。

效率非常高,一般可到 10*8,好時可到 10*9,特別適宜於大片段與文庫構建及珍貴材料的連接轉化。

潔淨是最重要的。無菌都無所謂,在操作台上可正常操作。離心力要注意不要超過 2500g,建議 1500-2000g 5min。塗板要注意,不要覺得不勻而多次反覆,輕輕在平板上帶一下感覺板上大部分地方走過即可,特別在冰箱中保存過或在溫箱中溫浴 2 小時以上的板。塗完後建議空氣晾乾(20-30 分鐘)這樣會減少衛星菌落出現。

預冷是必要的。整個過程的低溫也並非特別重要,只要注意就行了,在去殘液時經常在室溫倒置 1min,對感受態效率提高有幫助,第一次多加一點緩衝液,經常加至 20ml,效果不錯。

關於大腸桿菌的感受態製備及轉化的方法很多,最複雜的莫過於電轉化,而最簡單的則是將 LB 平板上的菌落直接挑入裝有緩衝液的 EP 管冰箱即開始轉化。

對於做克隆工作的人而言,高而穩定的感受態可減輕不少麻煩。

現在大腸桿菌轉化效率最高的要數電轉化,可達到 1010,但是操作起來比較麻煩。要想又簡單,又能有較高的轉化效率,最好的莫過於 1990 年《gene》上

刊登的由 Inoue H.等提出的高效感受態的製備與轉化方法。

根據實驗室的實際情況,我們將其稍作修改,做成了 GLP 文件,但其中仍有許多可改進或需要注意的地方,其中有一些對普通感受態效率的提高也有一定的幫助。

  1. 所用器具的潔淨程度。這一點非常重要,是所有與感受態有關的方法與文章上必講的,毋庸置疑。
  2. 培養基的裝量:培養基的裝量是很重要的,這關係到菌體生長過程中的能量代謝問題,是有氧還是無氧生長。厭氧生長出來的菌體是做不出效率高的感受態的。建議裝量不要高於此值為:培養基體積/三角瓶容量=100ml/500ml,50ml/250ml。
  3. 培養基的 pH 值。這是講的 pH 值並非單指配置或滅菌後的 pH 值,而且還包括整個搖瓶結束後的 pH 值。一般來說,接種前的 pH 值在 6.8-7.2,等菌搖好後,可以測一下 pH 值,不要低於 6.0,最好在 6.5 以上。這表示菌體的代謝為有氧代謝,生長狀態良好,按要求做,肯定效率不低。
  4. 培養後的 OD 值。其實這並一個非常重要的參數,只是當 OD 值大到一定的程度後,菌體要保持對數生長已經不太可能,因此很多指導方法上強調 OD 不得大於 0.6,0.8 等等。同時,OD 值大時菌體總量大,因而感受態絕對數量要大一點,因而需要在 OD 值的兩方面影響中找一個平衡點。
  5. 培養基中的各種離子。經驗證明,當培養基中存在一定量的 Mg2+離子時,該方法製得的感受態要相對較高。在製備普通感受時,使用 20mM MgCl2 做為培養基的添加物,在感受態收穫之前 20-30 分鐘加入,會收到很好的效果。
  6. 培養溫度。文獻及經驗告訴我們,較低的溫度培養有利於感受態的形成,這樣可以獲得較高的感受態,但太低又不實用,因而產生了 Inoue 的高效感受態製備方法,它實際是利用了所有有利於感受態的文獻而得出的一個非常理想方法。
  7. 此外文獻報導,在保存感受態時,DMSO 要比甘油的效果要好,它會使感受態的效率增加。
  8. 液氮速凍也會使感受態的效率提高,因此推薦用液氮速凍感受態,然後保存於超低溫冰箱內。至於在液氮中保存 12 小時以後再轉入超低溫冰箱,這點未做實驗,只是一種感覺,第一次這樣做了,沒問題,以後就照此辦理而已。

方法二[編輯]

  1. 液氮或低溫冰箱中取出的大腸桿菌*E.COLI DH5, JM109,HB101 等,在 LB 平板上劃線,37 度過夜至長出單菌落.
  2. 挑直徑 1-3 毫米的單菌落*可多個, 接種到 250 毫升/3 升錐形瓶 或 80 毫升/1 升錐形瓶的 SOB 培養基. 培養基量不可再多,會影響效率.
  3. 在18 度 150-250RPM 培養19-50 小時*沒有冷卻搖床的可在室溫, 但不可高於37 度.
  4. OD600 約0.4-0.8 時停止培養, 放在冰水中冷卻10 分鐘
  5. 4 度, 300RPM 離心15 分鐘, 回收菌體
  6. 去掉上清後, 用1/3 體積的冰冷TB 溶液懸浮, 在冷10 分鐘
  7. 再次離心回收菌體
  8. 用1/12.5 體積的TB 懸浮, 添加最終濃度為7%的DMSO, 再冷卻10 分鐘
  9. 0.1-1 毫升分裝, 直接在液氮中凍上.
  10. 在液氮或-80 度保存.

附2. 高效感受態細胞的製作[編輯]

方法一[編輯]

A 液:1M,MnCl2:

B 液:1M,HEPES,pH=6.2-6.8,用無菌水配,配後不需滅菌;

C 液 稱取CaCl2 0.10g,KCl 1.18g,全部轉入細口試劑瓶,然後加入46ml 三蒸水,輕輕振盪使所有組分充分溶解。將瓶塞蓋上並用牛皮紙、棉線包紮,然後放入滅菌鍋121℃高壓滅菌備用。取1 管B 液(0.6ml),全部加入C 液(46ml)中,混勻後,再用1ml 移液器加入3.3ml A 液,混勻冰浴即可使用。

劃線得到單菌落,37℃培養箱培養約17 小時, 挑取2-4 個形態飽滿的單菌落接種於裝有100ml SOB 培養基的三角瓶,37℃劇烈振盪(300 rpms)培養3-4 小時, 將培養溫度調至18℃劇烈振盪(3280 rpms)培養,其餘與普通感受態差不多,每管加入4ml TB 緩衝液,輕輕振盪,使菌體重新懸浮,加入280ml DMSO(可用國產分析純),混勻後分裝入1.5ml EP 管,冰上靜置15 分鐘。用紗布將所有裝有感受態的 EP 管包好,用棉線系好後放入液氮中速凍,在液氮中靜置 12 小時以上。

取出感受態放入-70℃超低溫冰箱備用。

效率非常高,一般可到 10*8,好時可到 10*9,特別適宜於大片段與文庫構建及珍貴材料的連接轉化。

潔淨是最重要的。無菌都無所謂,在操作台上可正常操作。離心力要注意不要超過 2500g,建議 1500-2000g 5min。塗板要注意,不要覺得不勻而多次反覆,輕輕在平板上帶一下感覺板上大部分地方走過即可,特別在冰箱中保存過或在溫箱中溫浴 2 小時以上的板。塗完後建議空氣晾乾(20-30 分鐘)這樣會減少衛星菌落出現。

預冷是必要的。整個過程的低溫也並非特別重要,只要注意就行了,我在去殘液時經常在室溫倒置 1min,對感受態效率提高有幫助,第一次多加一點緩衝液,我

經常加至 20ml,效果不錯。

關於大腸桿菌的感受態製備及轉化的方法很多,最複雜的莫過於電轉化,而最簡單的則是將 LB 平板上的菌落直接挑入裝有緩衝液的 EP 管冰箱即開始轉化。對於

做克隆工作的人而言,高而穩定的感受態可減輕不少麻煩。

現在大腸桿菌轉化效率最高的要數電轉化,可達到 1010,但是操作起來比較麻煩。

要想又簡單,又能有較高的轉化效率,最好的莫過於 1990 年《gene》上刊登的由 Inoue H.等提出的高效感受態的製備與轉化方法。

根據實驗室的實際情況,我們將其稍作修改,做成了 GLP 文件,但其中仍有許多可改進或需要注意的地方,其中有一些對普通感受態效率的提高也有一定的幫助。

  1. 所用器具的潔淨程度。這一點非常重要,是所有與感受態有關的方法與文章上必講的,毋庸置疑。
  2. 培養基的裝量:培養基的裝量是很重要的,這關係到菌體生長過程中的能量代謝問題,是有氧還是無氧生長。厭氧生長出來的菌體是做不出效率高的感受態的。建議裝量不要高於此值為:培養基體積/三角瓶容量=100ml/500ml,50ml/250ml。
  3. 培養基的 pH 值。這是講的 pH 值並非單指配置或滅菌後的 pH 值,而且還包括整個搖瓶結束後的 pH 值。一般來說,接種前的 pH 值在 6.8-7.2,等菌搖好後,可以測一下 pH 值,不要低於 6.0,最好在 6.5 以上。這表示菌體的代謝為有氧代謝,生長狀態良好,按要求做,肯定效率不低。
  4. 培養後的 OD 值。其實這並一個非常重要的參數,只是當 OD 值大到一定的程度後,菌體要保持對數生長已經不太可能,因此很多指導方法上強調 OD 不得大於 0.6,0.8 等等。同時,OD 值大時菌體總量大,因而感受態絕對數量要大一點,因而需要在 OD 值的兩方面影響中找一個平衡點。
  5. 培養基中的各種離子。經驗證明,當培養基中存在一定量的 Mg2+離子時,該方法製得的感受態要相對較高。在製備普通感受時,使用 20mM MgCl2 做為培養基的添加物,在感受態收穫之前 20-30 分鐘加入,會收到很好的效果。
  6. 培養溫度。文獻及經驗告訴我們,較低的溫度培養有利於感受態的形成,這樣可以獲得較高的感受態,但太低又不實用,因而產生了 Inoue 的高效感受態製備方法,它實際是利用了所有有利於感受態的文獻而得出的一個非常理想方法。
  7. 此外文獻報導,在保存感受態時,DMSO 要比甘油的效果要好,它會使感受態的效率增加。
  8. 液氮速凍也會使感受態的效率提高,因此推薦用液氮速凍感受態,然後保存於超低溫冰箱內。至於在液氮中保存 12 小時以後再轉入超低溫冰箱,這點未做實驗,只是一種感覺,第一次這樣做了,沒問題,以後就照此辦理而已。

方法二[編輯]

  1. 液氮或低溫冰箱中取出的大腸桿菌*E.COLI DH5, JM109,HB101 等,在 LB 平板上劃線,37 度過夜至長出單菌落.
  2. 挑直徑 1-3 毫米的單菌落*可多個, 接種到 250 毫升/3 升錐形瓶 或 80 毫升/1 升錐形瓶的 SOB 培養基. 培養基量不可再多,會影響效率.
  3. 在 18 度 150-250RPM 培養 19-50 小時*沒有冷卻搖床的可在室溫, 但不可高於37 度.
  4. OD600 約 0.4-0.8 時停止培養, 放在冰水中冷卻 10 分鐘
  5. 4 度, 300RPM 離心 15 分鐘, 回收菌體
  6. 去掉上清後, 用 1/3 體積的冰冷 TB 溶液懸浮, 在冷 10 分鐘
  7. 再次離心回收菌體
  8. 用 1/12.5 體積的 TB 懸浮, 添加最終濃度為 7%的 DMSO, 再冷卻 10 分鐘
  9. 0.1-1 毫升分裝, 直接在液氮中凍上.
  10. 在液氮或-80 度保存.

方法三[編輯]

  1. 將置於液氮保存的大腸桿菌劃線在 LB 平板上,37℃培養活化。
  2. 挑取經活化的大腸桿菌單菌落於 SOC 液體培養基,18℃,200-250rpm 培養。
  3. 當 OD600=0.5-0.8 時,用預冷的 40mL 離心管於 4℃,8000rpm 離心 10min,收集菌體。
  4. 用預冷的 TB Buffer 重懸菌體,4℃,8000rpm 離心 10min,收集菌體。
  5. 重複第 4 步操作。
  6. 用 8mL 預冷的 TB Buffer 重懸菌體,緩慢加入 DMSO 至終濃度 7% 。
  7. 冰浴 10min 後,分裝保存於液氮中。

本法效率極高,建議大家採納

方法四[編輯]

  1. 單菌落-------2ml LB 37 度 120RPM 過夜------1%轉接-------37 度 200RPM2 小時(OD 到 0.4~0.5)
  2. 2ml, 冰浴 15min, 4 度, 6000RPM 5min, 棄上清, 懸浮於 1ml0.1MCaCl2 中, 冰浴 20min
  3. 4 度, 6000RPM 10min, 重懸浮於 200ul 0.1MCaCl2 中, 冰浴 30min

建議用 TSS 法,簡單方便,比氯化鈣法的轉化效率高.別的菌可能不一定適用。

方法五:E.coli 感受態細胞製備方法[編輯]

單菌落平板至 2ml LB, 37℃ 250 r/m, 1ml 轉至 50 ml LB, 37oC 250 r/m 至A600=0.2-0.4

離心後用 10 毫升 TSS 重懸後,分裝 -70oC 保存。儘量冰上操作.

轉化: 加質體(<5 ul/100ul cell) 後冰上30 分鐘,42℃ 90 秒,冰上2 分鐘,加LB 至1ml, 37℃ 1 小時後鋪抗生素平板。

TSS:

7.0ml pH6.1 LB

2.0ml 50% PEG6000

0.5ML dmso

0.2ML Mg2+ (0.1ml 1mol/l MgCl2 and 0.1ml 1mol/l MgSO4)

0.3ml ddH2O

枯草芽孢桿菌感受態細胞的製備及轉化[編輯]

以枯草芽孢桿菌168(Bacillus subtilis 168)為例

枯草桿菌化學感受態製備及轉化方法[編輯]

  1. 準備新鮮的168單克隆平板,取一滿環枯草芽孢桿菌甘油菌劃LB平板,37°C培養箱培養12 h;
  2. 轉化前一天晚間挑單菌落至3 ml LB 培養基中,37°C,250 r/min 培養過夜;
  3. 第二天上午取160 μl 培養液轉接至8 ml SPI 培養基中,37°C,250 r/min 培養至對數生長末期(168 約4-5 h);
  4. 取0.2 ml 生長至對數期末的培養液至2 ml SPII 培養基中,37 °C,100 r/min培養90 分鐘;
  5. 在上述 SPII 培養基的菌體中加入 20 μl 10mmol/L EGTA,再於 37°C,100r/min 培養 10 分鐘;
  6. 將上述處理後的菌液分裝成 0.5 ml 每管,各加入 5 μl DNA(DNA 量不能過高,不超過 5μg),再於 37 °C,250 r/min 培養 90 分鐘,取菌液塗布篩選平板。

相關試劑配方如下:

SP 鹽:0.2%( NH ) SO ,1.4% K HPO ,0.6% KH PO ,0.02% MgSO ⋅7H O,0.1% 檸檬酸鈉;CAYE (100×):2 % Casamino acid,10%酵母膏。

SPI 培養基: SP 鹽溶液加入 1 %體積濃度為 50%葡萄糖溶液,1 %體積 100×CAYE溶液;

SPII 培養基:SPI 培養基加入 1 %體積 50 mmol/L CaCl 溶液,1 %體積 250 mmol/L MgCl 溶液。


z 試劑

SP-A Salts Solution:(500 ml Solution)

0.4% (NH ) SO 2g

2.8% K HPO ·3H O 14g

1.2% KHPO 6g

0.2% Trisodium Citrate Dihydrate 1g

121℃滅菌 20min


SP-B Salts Solution:(500 ml Solution)

0.04% MgSO ·7H O 0.2g

121℃滅菌 20min

100× CAYE Solution:(100 ml Solution)

2% Casamino acid 2g

Yeast Extract 10% 10g


121℃滅菌 20min

SPI Medium:(20 mL)

9.8mL SP-A Salts Solution

9.8mL SP-B Salts Solution

200µL (1%V)Glucose(50%w/v,115℃滅菌 20min)

200µL (1%V)100× CAYE

SPII Medium:(6 mL)

5.88mL SPI Medium

60µL (1%V)50mM CaCl2

60µL (1%V)250mM MgCl2

100×EGTA Solution:10mmol/L EGTA 溶液,溶解時需加少量 NaOH 至 pH8.0

注意[編輯]

  1. 注意儀器用品的乾淨和無菌;
  2. 8ml SPI 培養基要放於 50ml 離心管中培養,以保證菌體的生長狀態,不要使用玻璃試管;
  3. 注意測定 OD 值,一定要等菌體生長至對數期後期;
  4. 保證菌體的濃度,可以提高轉化率。

酵母感受態細胞的製備及轉化[編輯]

以畢赤酵母為例說明其感受態細胞製備及轉化。

對於畢赤酵母的轉化目前有 4 種方法:

  1. 鋰鹽法;
  2. PEG 法;
  3. 原生質體法;
  4. 電穿孔法。

鋰鹽法和 PEG 法方法簡便,但效率很低,每微克 DNA 只有幾十個轉化子或更低,一般不多用。原生質體法和電穿孔法轉化率都較高,且一般可得到高拷貝重組,其轉化率都可達到 10 /μg。但因原生質體法操作繁瑣費時,所以簡便、快速、高效的電穿孔法是理想的轉化方法。

對以上幾種方法分述如下:

畢氏酵母氯化鋰轉化法[編輯]

試劑[編輯]

1M LiCl(用去離子蒸餾水配製,濾膜過濾除菌;必要時用消毒去離子水稀釋)

50% PEG3350(Sigma P3640 用去離子蒸餾水配製,濾膜過濾除菌,用較緊的蓋子的瓶子分裝)

2mg/ml salmon sperm DNA / TE(10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA)-20℃保存

註:醋酸鋰對畢氏酵母無效,僅氯化鋰有效;PEG3350 可屏蔽高濃度 LiCl 的毒害作用;

感受態畢氏酵母的製備[編輯]

  1. 接種 Pachia pastoris 到 50ml YPD 培養基中,30℃搖菌過夜(約 24~28h)培養到 OD 值為 0.8~1.0(約 108 Cells/ml);
  2. 收穫細胞,用 25ml 無菌水洗滌一次,室溫下 1500g 離心 10min;
  3. 重懸細胞於 1ml 100mM LiCl 溶液中,將懸液轉入 1.5ml 離心管;
  4. 離心機最大速度離心 15 秒沉澱菌體,重懸菌體於 400ul 100mM LiCl 溶液中;
  5. 按 50ul/管分裝,立即進行轉化;

註:不要將感受態酵母菌冰浴;

畢氏酵母的轉化[編輯]

  • 煮沸 1ml 鮭魚精 DNA 5min,迅速冰浴以製備單鏈擔體 DNA;
  • 將感受態酵母菌離心,以 Tips 去除殘餘的 LiCl 溶液;
  • 對於每一個轉化,按以下順序加入:

50% PEG3350

240ul

36ul

25ul

50ul

1M LiCl

2mg/ml 單鏈 Salmon sperm DNA

5~10ug/50ul H2O 質體 DNA

  • 劇烈旋渦混勻直至沉澱菌體完全分布均勻(約 1min);
  • 30℃水浴孵育 30min;
  • 42℃水浴熱休克 20~25min;@
  • 6000~8000rpm 離心收集酵母菌體;
  • 重懸酵母於 1ml YPD 培養基,30℃搖床孵育;
  • 1~4h 後, 取 25~100ul 菌液鋪選擇性培養基平板,於 30℃培養 2~3天鑑定;

畢氏酵母 PEG1000 轉化法[編輯]

  • 試劑

緩衝液 A:1.0M Sorbitol,10mM Bicine,pH8.35(sigma),3%(v/v)ethylene glycol

緩衝液 B:40%(w/v)PEG1000(sigma),0.2M Bicine,pH8.35

緩衝液 C:0.15M NaCl,10mM Bicine,pH8.35

未污染的新鮮、試劑級 DMSO,-70℃保存!

註:

  1. 緩衝液 A、B、C 均用濾膜過濾,-20℃保存;將 DNA 直接加在凍結的酵母細胞上是本實驗的關鍵之處(即使在冰上解凍的待轉化細胞,其攝取外源 DNA 的能力也在解凍過程中迅速下降;如進行多樣品的轉化,建議按 6 樣品/組進行)
  2. 待轉化畢氏酵母的製備
    • 接種環接種 Pachia pastoris 於 YPD 平板,30℃培養 2d;
    • 挑取單克隆酵母菌株於 10mlYPD 培養基中,30℃振盪培養過夜;
    • 取步驟 2 中小量菌液接種到 100mlYPD 培養基中振盪培養,待其 OD 值從 0.1 升到 0.5~0.8;
    • 室溫下 3000g 離心收集酵母菌體,50ml 緩衝液 A 洗滌一次;
    • 重懸菌體於 4ml 緩衝液 A 中,按 0.2ml/管分裝於 1.5ml 的離心管中,每管加入 11ulDMSO,混合後迅速於液氮中冷凍,
    • -70℃保存
  3. 畢氏酵母的轉化
    • 將約 50ug 線性化質體 DNA 溶於 20ul TE 或水中,直接加於凍結的酵母細胞中;加入擔體 DNA(40ug 變性超聲線性化鮭魚精 DNA)以獲得最大轉化率;
    • 37℃水浴孵育 5min,中間混合樣品 1~2 次;
    • 取出離心管,加入 1.5ml 緩衝液 B,徹底混勻;
    • 30℃水浴孵育 1h;
    • 室溫下 2000g 離心 10min,去除上清液,菌體沉澱重懸於 1.5ml 緩衝液 C 中;
    • 離心樣品,去除上清液,輕微操作將樣品重懸於 0.2ml 緩衝液 C 中;
    • 將所有轉化液鋪於選擇性平板,於 30℃孵育 3~4 天后,鑑定;

畢氏酵母電轉化法[編輯]

感受態細胞的製備[編輯]

  1. 取 10ul TOP10F』菌液,接種於 200ml LB 液體培養基中活化培養,37℃,200 rpm,16~18 小時。取 100ul 菌液接種於 200ml 液體 LB 培養基中。
  2. 37℃,200 rpm,培養 16~18 小時。
  3. 滅菌 500 ml 離心管,4℃,4000 rpm,20 min。得菌體沉澱。棄上清,菌體用 10%甘油重懸並洗滌。重複洗滌 3 次。
  4. 第三次離心後,棄絕大部分上清,留下約 1ml 液體用於重懸菌體。
  5. 從製得得感受態細胞中,取 200ul 於滅菌 EP 管中,加入連接反應產物 5ul,混勻,不要產生氣泡,在冰上放置 5min。
  6. 將混勻後得 200ul 菌液移入電擊杯中。
  7. 使用電擊穿孔儀進行轉化,設置為 電壓 2500 V,時間 5 ms。
  8. 電擊後,往電擊杯中加入 800ul SOC 培養基,沖洗出菌體,轉移至滅菌1.5 ml EP 管中。37℃,150 rpm ,輕搖 45~60 min。
  9. 取全部均勻塗布於含 Zeocin 25 ug/ml 的 LLB-Zeocin 平板上,正放,待塗布液不在流動,37℃ 培養 12~16 小時。

線性化質體 DNA 對 Pichia pastorisGS115 的轉化[編輯]

取新鮮製備的(或-70℃凍存的)感受態細胞置於冰浴中,使其完全解凍;

1) 將 100μl 菌體移出至一新的無菌 Eppendorf 管中,加入 5-20μg 線性化質體(5~10μl),輕彈混勻,盡數吸出轉移到 0.2cm 型的電穿孔轉化杯中;

2) 轉化杯置於冰浴中 5~10 分鐘,保持低溫。

3) 電穿孔轉化電擊條件:電壓:1500V;電阻:400Ω;電容:25μF;脈衝時間:10mS;一次電擊。

4) 電擊後,馬上在電擊轉化杯中加入 1ml 4℃預冷的 1M 的山梨醇溶液,用微量移液槍吹打均勻,置於冰浴中;

5) 取 30℃烘至表面半乾的 MD 培養基平板,在超淨工作檯上無菌操作塗布平板,400μl/板;

感受態製備關鍵點[編輯]

甘油的質量,水的質量,最好是 miniQ 的,如果要求完美,洗瓶不要有洗滌劑殘留,先將瓶裝滿 miniQ 水高壓,再棄去,再配置 10%甘油。收菌以半對數期合適,一般 OD 0.5 收菌,過則不佳,直接取-80 度菌種搖,次日轉種,從盤上菌落搖的要差,33-34℃搖菌結果更理想。在以冰冷 10%甘油等量,半量,1/4 量洗滌時一定低溫,重懸時應輕盪,棄洗滌液應倒干靜,那怕損掉部分細菌。最後大概 500ml能做 3-4ml 感受態,液氮中凍 10min 轉-80 度冰箱,快一點,免的 EP 管爆了,也可不冷凍,直接用來轉化。感受態應以標準濃度質體電轉記算效率,一般大於10 /mg,操做以 1ng/ul 質體 1ul 加 40ul 感受態置 0.1 杯,電轉後以最快的速度加入1ml SOC 復活,100-150 轉搖 1hl,取 1/1000 鋪盤應大於 1000 個菌生長。這樣用於建庫工作才行。電轉時質體或連接物儘可能少,以減少離子,實際上離子高,電流直接通過,沒有場強,質體是進不去的。

註:

  1. 任和有關東西都要乾淨,保證沒有離子,
  2. 從接觸甘油開始就保持恆溫,0℃,
  3. 電擊後復活要快。

關於載體連接的討論[編輯]

相信凡是做過分子生物學的人應該都對載體構建有所了解,而載體構建中基因片段同載體的連接是一個關鍵所在,現就同載體連接相關內容討論如下:

  1. 連接的反應溫度:DNA 連接酶的最適反應溫度為 37℃,但在此溫度下,分子布朗運動速度過快,連接後末端的氫鍵結合變的很不穩定,致使剛連接後的片段又大量的解離,所以連接反應不能在過高的溫度中進行;但是,隨著溫度的降低,連接酶的活性降低,故為保證連接的效率,採取折衷方法是 16℃過夜,這樣能夠保證獲得最佳的連接效果。當然,也不是所有的連接反應都是在 16℃下最好,也可以採用 12℃過夜,或者 37℃下反應 30min 然後 4℃過夜等等,這需要根據實際情況調整;
  2. 限制性內切酶在反應中是不需要外部提供能量的,但是 T4 DNA 連接酶需要在外部提供能量的情況下才能完成連接反應,因此,能量 ATP 的充分供給將是連接反應成敗的另一關鍵因素。對於商業化的 DNA 連接酶來說,一般 ATP 都是在提供緩衝 buffer 中的,而 ATP 是不穩定的,隨著時間的延長,ATP 會大量的消耗,為了解決能量即 ATP 的問題,建議對於難以連接的片段,不妨採用下面的方法試試:

先以正常的體系連接(10μl 體系中含 1μl 酶、1μbuffer、片段、載體)(16℃)連接 4-6h,然後在該體系中再加入 1μl buffer 以提供充足的 ATP,而此時可以不用考慮反應體系中鹽離子濃度等,因為此時能量是更為重要的問題。

當然,連接反應還有其他許多因素,比如載體和片段的比例、片段末端形態等等這些都在此暫不討論,只提供以上兩點供參考。