生物化學與分子生物學/蛋白質實驗技術/蛋白質膠的製備

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將收集的各樣品加入等體積的2×SDS-PAGE Loading Buffer,煮沸裂解5min,冰浴2min,12,000rpm離心10min,取上清-20℃保存備用。

SDS-PAGE蛋白質電泳(參照分子克隆實驗指南操作)(薩姆布魯克,2002)

  • 按照電泳裝置的使用說明,裝好潔淨乾燥的玻璃板。
  • 分離膠的製備

按下列成分配製10mL 12%分離膠:

ddH2O

30%丙烯醯胺混合液

1.5M Tris(pH8.8)

10%SDS

10%過硫酸銨

TEMED

3.3 mL

4.0 mL

2.5 mL

0.1 mL

0.1 mL

0.004 mL

總體積 10 mL

各成分加入後迅速旋渦混勻,用微量移液器將其小心地注入準備好的玻璃板間隙中,並為積層膠留出足夠空間。輕輕在頂層加入一薄層水封頂,以防止空氣中的氧對凝膠聚合的抑制作用。凝膠聚合完成後,倒掉覆蓋的水層,用水清洗凝膠頂部數次,用濾紙吸乾凝膠頂端的水。

  • 積層膠的製備

按下列成分配製2mL 5%的積層膠:

ddH2O

30%丙烯醯胺混合液

1.0M Tris(pH6.8)

10%SDS

10%過硫酸銨

TEMED

1.4mL

0.33mL

0.25mL

0.02mL

0.02mL

0.002mL

總體積 2mL

各成分加入後迅速旋渦混勻,用微量移液器將其灌注到分離膠上,灌滿後小心插入加樣梳,儘可能避免產生氣泡。

  • 待積層膠凝固後,小心拔下梳子。
  • 將凝膠固定於電泳裝置上,加入足量的1×Tris-甘氨酸電泳緩衝液,在加樣孔中分別加入20μL各樣品。
  • 樣品在積層膠中電泳時,使用80V電壓,待溴酚藍帶進入分離膠後,將電壓升至120V,繼續電泳直至溴酚藍帶到達分離膠的底部且開始泳出膠底面,關閉電源。
  • 卸下凝膠,將其浸泡在至少5倍體積的考馬斯亮藍R-250染色液中,置水平搖床上室溫染色至少4h,之後取出染色的凝膠並回收染液,以備再用,將凝膠浸泡於考馬斯亮藍脫色液中,在水平搖床上脫色4~8h,其間更換脫色液3~4次,直至凝膠脫色到條帶清晰為止,觀察記錄結果並拍照。