生物化學與分子生物學/蛋白質實驗技術/蛋白質膠的製備

將收集的各樣品加入等體積的2×SDS-PAGE Loading Buffer，煮沸裂解5min，冰浴2min，12,000rpm離心10min，取上清-20℃保存備用。

SDS-PAGE蛋白質電泳（參照分子克隆實驗指南操作）(薩姆布魯克,2002)

按下列成分配製10mL 12%分離膠：

ddH2O 30%丙烯醯胺混合液 1.5M Tris(pH8.8) 10%SDS 10%過硫酸銨 TEMED	3.3 mL 4.0 mL 2.5 mL 0.1 mL 0.1 mL 0.004 mL
總體積	10 mL

各成分加入後迅速旋渦混勻，用微量移液器將其小心地注入準備好的玻璃板間隙中，並為積層膠留出足夠空間。輕輕在頂層加入一薄層水封頂，以防止空氣中的氧對凝膠聚合的抑制作用。凝膠聚合完成後，倒掉覆蓋的水層，用水清洗凝膠頂部數次，用濾紙吸乾凝膠頂端的水。

按下列成分配製2mL 5%的積層膠：

ddH2O 30%丙烯醯胺混合液 1.0M Tris(pH6.8) 10%SDS 10%過硫酸銨 TEMED	1.4mL 0.33mL 0.25mL 0.02mL 0.02mL 0.002mL
總體積	2mL

各成分加入後迅速旋渦混勻，用微量移液器將其灌注到分離膠上，灌滿後小心插入加樣梳，儘可能避免產生氣泡。

待積層膠凝固後，小心拔下梳子。
將凝膠固定於電泳裝置上，加入足量的1×Tris-甘氨酸電泳緩衝液，在加樣孔中分別加入20μL各樣品。
樣品在積層膠中電泳時，使用80V電壓，待溴酚藍帶進入分離膠後，將電壓升至120V，繼續電泳直至溴酚藍帶到達分離膠的底部且開始泳出膠底面，關閉電源。
卸下凝膠，將其浸泡在至少5倍體積的考馬斯亮藍R-250染色液中，置水平搖床上室溫染色至少4h，之後取出染色的凝膠並回收染液，以備再用，將凝膠浸泡於考馬斯亮藍脫色液中，在水平搖床上脫色4~8h，其間更換脫色液3~4次，直至凝膠脫色到條帶清晰為止，觀察記錄結果並拍照。