生物化學與分子生物學/蛋白質實驗技術/ELISA步驟、試劑及注意事項

操作步驟

方法一：用於檢測未知抗原的雙抗體夾心法

1. 包被：用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩衝液將抗體稀釋至蛋白質含量為1～10μg／ml。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml，4℃過夜。次日，棄去孔內溶液，用洗滌緩衝液洗3次，每次3分鐘。(簡稱洗滌，下同)。
2. 加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml於上述已包被之反應孔中，置37℃孵育1小時。然後洗滌。(同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔)。
3. 加酶標抗體：於各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體(經滴定後的稀釋度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小時，洗滌。
4. 加底物液顯色：於各反應孔中加入臨時配製的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分鐘。
5. 終止反應：於各反應孔中加入2M硫酸0.05ml。
6. 結果判定：可於白色背景上，直接用肉眼觀察結果：反應孔內顏色越深，陽性程度越強，陰性反應為無色或極淺，依據所呈顏色的深淺，以「+」、「-」號表示。也可測O·D值：在ELISA檢測儀上，於450nm(若以ABTS顯色，則410nm)處，以空白對照孔調零後測各孔O·D值，若大於規定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。

方法二　用於檢測未知抗體的間接法：

用包被緩衝液將已知抗原稀釋至1～10μg／ml，每孔加0.1ml，4℃過夜。次日洗滌3次。加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.1ml於上述已包被之反應孔中,置37℃孵育1小時,洗滌。(同時做空白、陰性及陽性孔對照)於反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標第二抗體(抗抗體)0.1ml，37℃孵育30-60分鐘，洗滌,最後一遍用DDW洗滌。其餘步驟同「雙抗體夾心法」的4、5、6。

試劑器材

試劑

1. 包被緩衝液(PH9.6 0.05M碳酸鹽緩衝液):NaCO3?1.59克　NaHCO3　 2.93克　　加蒸餾水至1000ml　　
2. 洗滌緩衝液(PH7.4 PBS)：0.15M　KH2PO4 0.2克　Na2HPO4·12H2O　2.9克　NaCl 8.0克KCl 0.2克 Tween-20 0.05％ 0.5ml 加蒸餾水至1000ml
3. 稀釋液:牛血清白蛋白(BSA) 0.1克　加洗滌緩衝液至100ml　或以羊血清、兔血清等 血清與洗滌液配成5～10％使用。
4. 終止液(2M H2SO4）：蒸餾水178.3ml，逐滴加入濃硫酸(98％)21.7ml。
5. 底物緩衝液(PH5.0磷酸棗檸檬酸):0.2M Na2HPO4(28.4克／L) 25.7ml　0.1M 檸檬酸(19.2克／L) 24.3ml　加蒸餾水50ml。
6. TMB(四甲基聯苯胺)使用液:TMB(10mg／5ml無水乙醇) 0.5ml底物緩衝液(PH5.5) 10ml0.75％H2O2　32μl
7. ABTS使用液:ABTS　0.5mg　底物緩衝液(PH5.5) 1ml　3％H2O2　2μl
8. 抗原、抗體和酶標記抗體。
9. 正常人血清和陽性對照血清。

器材

1. 聚苯乙烯塑料板(簡稱酶標板)40孔或96孔，ELISA檢測儀，50μl及100μl加樣器，塑料滴頭，小毛巾，洗滌瓶。
2. 小燒杯、玻璃棒、試管、吸管和量筒等。
3. 4℃冰箱，37℃孵育箱。

注意事項

1. 正式試驗時，應分別以陽性對照與陰性對照控制試驗條件，待檢樣品應作一式二份，以保證實驗結果的準確性。有時本底較高，說明有非特異性反應，可採用羊血清、兔血清或BSA等封閉。
2. 在ELISA中，進行各項實驗條件的選擇是很重要的，其中包括:
   • 固相載體的選擇：許多物質可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙醯胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進行篩選：用等量抗原包被，在同一實驗條件下進行反應，觀察其顯色反應是否均一性，據此判明其吸附性能是否良好。
   • 包被抗體(或抗原)的選擇：將抗體(或抗原)吸附在固相載體表面時，要求純度要好,吸附時一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時間及其蛋白量也有一定影響,一般多採用4℃18～24小時。蛋白質包被的最適濃度需進行滴定：即用不同的蛋白質濃度(0.1、1.0和10μg／ml等)進行包被後，在其它試驗條件相同時，觀察陽性標本的OD值。選擇OD值最大而蛋白量最少的濃度。對於多數蛋白質來說通常為1～10μg／ml。
   • 酶標記抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進行初步效價的滴定(見酶標記抗體部份)。然後再固定其它條件或採取「方陣法」(包被物、待檢樣品的參考品及酶標記抗體分別為不同的稀釋度)在正式實驗系統裡準確地滴定其工作濃度。
   • 酶的底物及供氫體的選擇：對供氫體的選擇要求是價廉、安全、有明顯地顯色反應，而本身無色。有些供氫體(如OPD等)有潛在的致癌作用，應注意防護。有條件者應使用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是目前較為滿意的供氫體。底物作用一段時間後，應加入強酸或強鹼以終止反應。通常底物作用時間，以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配製，尤其是H2O2在臨用前加入。