生物化學與分子生物學/蛋白質實驗技術/ELISA步驟、試劑及注意事項

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操作步驟[編輯]

方法一:用於檢測未知抗原的雙抗體夾心法[編輯]

  1. 包被:用0.05M PH9.牰碳酸鹽包被緩衝液將抗體稀釋至蛋白質含量為1~10μg/ml。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml,4℃過夜。次日,棄去孔內溶液,用洗滌緩衝液洗3次,每次3分鐘。(簡稱洗滌,下同)。
  2. 加樣:加一定稀釋的待檢樣品0.1ml於上述已包被之反應孔中,置37℃孵育1小時。然後洗滌。(同時做空白孔,陰性對照孔及陽性對照孔)。
  3. 加酶標抗體:於各反應孔中,加入新鮮稀釋的酶標抗體(經滴定後的稀釋度)0.1ml。37℃孵育0.5~1小時,洗滌。
  4. 加底物液顯色:於各反應孔中加入臨時配製的TMB底物溶液0.1ml,37℃10~30分鐘。
  5. 終止反應:於各反應孔中加入2M硫酸0.05ml。
  6. 結果判定:可於白色背景上,直接用肉眼觀察結果:反應孔內顏色越深,陽性程度越強,陰性反應為無色或極淺,依據所呈顏色的深淺,以「+」、「-」號表示。也可測O·D值:在ELISA檢測儀上,於450nm(若以ABTS顯色,則410nm)處,以空白對照孔調零後測各孔O·D值,若大於規定的陰性對照OD值的2.1倍,即為陽性。

方法二 用於檢測未知抗體的間接法:[編輯]

用包被緩衝液將已知抗原稀釋至1~10μg/ml,每孔加0.1ml,4℃過夜。次日洗滌3次。加一定稀釋的待檢樣品(未知抗體)0.1ml於上述已包被之反應孔中,置37℃孵育1小時,洗滌。(同時做空白、陰性及陽性孔對照)於反應孔中,加入新鮮稀釋的酶標第二抗體(抗抗體)0.1ml,37℃孵育30-60分鐘,洗滌,最後一遍用DDW洗滌。其餘步驟同「雙抗體夾心法」的4、5、6。

試劑器材[編輯]

試劑[編輯]
  1. 包被緩衝液(PH9.6 0.05M碳酸鹽緩衝液):NaCO3?1.59克 NaHCO3  2.93克  加蒸餾水至1000ml  
  2. 洗滌緩衝液(PH7.4 PBS):0.15M KH2PO4 0.2克 Na2HPO4·12H2O 2.9克 NaCl 8.0克KCl 0.2克 Tween-20 0.05% 0.5ml 加蒸餾水至1000ml
  3. 稀釋液:牛血清白蛋白(BSA) 0.1克 加洗滌緩衝液至100ml 或以羊血清、兔血清等 血清與洗滌液配成5~10%使用。
  4. 終止液(2M H2SO4):蒸餾水178.3ml,逐滴加入濃硫酸(98%)21.7ml。
  5. 底物緩衝液(PH5.0磷酸棗檸檬酸):0.2M Na2HPO4(28.4克/L) 25.7ml 0.1M 檸檬酸(19.2克/L) 24.3ml 加蒸餾水50ml。
  6. TMB(四甲基聯苯胺)使用液:TMB(10mg/5ml無水乙醇) 0.5ml底物緩衝液(PH5.5) 10ml0.75%H2O2 32μl
  7. ABTS使用液:ABTS 0.5mg 底物緩衝液(PH5.5) 1ml 3%H2O2 2μl
  8. 抗原、抗體和酶標記抗體。
  9. 正常人血清和陽性對照血清。
器材[編輯]
  1. 聚苯乙烯塑料板(簡稱酶標板)40孔或96孔,ELISA檢測儀,50μl及100μl加樣器,塑料滴頭,小毛巾,洗滌瓶。
  2. 小燒杯、玻璃棒、試管、吸管和量筒等。
  3. 4℃冰箱,37℃孵育箱。

注意事項[編輯]

  1. 正式試驗時,應分別以陽性對照與陰性對照控制試驗條件,待檢樣品應作一式二份,以保證實驗結果的準確性。有時本底較高,說明有非特異性反應,可採用羊血清、兔血清或BSA等封閉。
  2. 在ELISA中,進行各項實驗條件的選擇是很重要的,其中包括:
    • 固相載體的選擇:許多物質可作為固相載體,如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙醯胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體,在使用前均可進行篩選:用等量抗原包被,在同一實驗條件下進行反應,觀察其顯色反應是否均一性,據此判明其吸附性能是否良好。
    • 包被抗體(或抗原)的選擇:將抗體(或抗原)吸附在固相載體表面時,要求純度要好,吸附時一般要求PH在9.0~9.6之間。吸附溫度,時間及其蛋白量也有一定影響,一般多採用4℃18~24小時。蛋白質包被的最適濃度需進行滴定:即用不同的蛋白質濃度(0.1、1.0和10μg/ml等)進行包被後,在其它試驗條件相同時,觀察陽性標本的OD值。選擇OD值最大而蛋白量最少的濃度。對於多數蛋白質來說通常為1~10μg/ml。
    • 酶標記抗體工作濃度的選擇:首先用直接ELISA法進行初步效價的滴定(見酶標記抗體部份)。然後再固定其它條件或採取「方陣法」(包被物、待檢樣品的參考品及酶標記抗體分別為不同的稀釋度)在正式實驗系統里準確地滴定其工作濃度。
    • 酶的底物及供氫體的選擇:對供氫體的選擇要求是價廉、安全、有明顯地顯色反應,而本身無色。有些供氫體(如OPD等)有潛在的致癌作用,應注意防護。有條件者應使用不致癌、靈敏度高的供氫體,如TMB和ABTS是目前較為滿意的供氫體。底物作用一段時間後,應加入強酸或強鹼以終止反應。通常底物作用時間,以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配製,尤其是H2O2在臨用前加入。