生物化學與分子生物學/DNA實驗技術/變性梯度凝膠電泳

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實驗原理[編輯]

變性梯度凝膠電泳(DGGE)是一種根據DNA片段的熔解性質而使之分離的凝膠系統。核酸的雙螺旋結構在一定條件下可以解鏈,稱之為變性。核酸50%發生變性時的溫度稱為熔解溫度(Tm)。Tm值主要取決於DNA分子中GC含量的多少。DGGE將凝膠設置在雙重變性條件下:溫度50~60 ℃,變性劑0~100%。當一雙鏈DNA片段通過一變性劑濃度呈梯度增加的凝膠時,此片段遷移至某一點變性劑濃度恰好相當於此段DNA的低熔點區的Tm值,此區便開始熔解,而高熔點區仍為雙鏈。這種局部解鏈的DNA分子遷移率發生改變,達到分離的效果。Tm的改變依賴於DNA序列,即使一個鹼基的替代就可引起Tm值的升高和降低。因此,DGGE可以檢測DNA分子中的任何一種單鹼基的替代、移碼突變以及少於10個鹼基的缺失突變。

為了提高DGGE的突變檢出率,可以人為地加入一個高熔點區——GC夾。GC夾(GC clamp)就是在一側引子的5′端加上一個30~40bp的GC結構,這樣在PCR產物的一側可產生一個高熔點區,使相應的感興趣的序列處於低熔點區而便於分析。因此,DGGE的突變檢出率可提高到接近於100%。

作為一種突變檢測技術,DGGE具有如下的優點:

  1. 突變檢出率高。DGGE的突變檢出率為99%以上。
  2. 檢測片段長度可達1kb,尤其適用於100~500bp的片段。
  3. 非同位素性。DGGE不需同位素摻入,可避免同位素污染及對人體造成的傷害。
  4. 操作簡便、快速。DGGE一般在24小時內即可獲得結果。
  5. 重複性好。但是,該方法需要特殊的儀器,而且合成帶GC夾的引子也比較昂貴。

實驗方法[編輯]

  • 變性梯度凝膠電泳(DGGE)

實驗材料[編輯]

  • DNA樣品

試劑、試劑盒[編輯]

  • 尿素
  • 去離子甲醯胺
  • 丙烯醯胺
  • 甲叉雙丙烯醯胺
  • 瓊脂糖

儀器、耗材[編輯]

  • PCR擴增儀
  • 變性梯度凝膠電泳儀
  • 凝膠成像及分析系統
  • 紫外透射儀
  • 高速離心機
  • 電泳儀
  • 電泳槽
  • 微量加樣器(200μl,20μl);Tip頭(200μl,20μl)
  • Tip頭
  • Tip頭盒(200μl,20μl)
  • Eppendorf管(0.5ml,0.2ml)
  • Eppendorf管架
  • PCR擴增相關試劑

實驗步驟[編輯]

  1. PCR反應(同前):其中,上游引子加40bp [GC] Clamp。
  2. PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳確認。
  3. 垂直變性梯度凝膠電泳:變性梯度遞增的方向與電泳方向垂直。所使用的膠為6%聚丙烯醯胺凝膠,變性濃度為0~100%。其中,含7 M尿素和40%去離子甲醯胺的膠為100%變性,不含尿素和去離子甲醯胺的膠為0%變性。垂直變性梯度凝膠電泳主要是檢測引子的最適解鏈條件(即變性濃度)。PCR產物加上樣緩衝液後上樣,300~400μl/孔,電壓150V,溫度60℃,時間2~4小時。
  4. 平行變性梯度凝膠電泳:變性梯度遞增的方向與電泳方向平行。根據垂直變性梯度凝膠電泳檢測的解鏈區域的變性濃度,製備相應變性濃度的平行變性梯度凝膠,檢測各標本是否存在突變。PCR產物加上樣緩衝液後,25μl~30μl/孔,電壓150V,溫度60℃,時間3~6小時。
  5. 染色5分鐘,凝膠成像儀分析結果。

注意事項[編輯]

  1. 該實驗中提取DNA,以及DGGE操作中接觸到得很多藥品都有毒,還有致癌、變性等毒害,一定要嚴格操作,做好防護保護自己。
  2. 嚴格按操作步驟。