生物化學與分子生物學/PCR實驗技術/AFLP原理及操作步驟
AFLP是通過限制性內切酶片段的不同長度檢測DNA多態性的一種DNA分子標記技術。本AFLP 技術主要特點 ：分析所需 DNA 量少，僅需 0.5g；可重複性好；多態性強；解析度高；不需要 Southern 雜交；樣品適用性廣；穩定的遺傳性。在技術特點上，AFLP 實際上是 RAPD 和 RFLP 相結合的一種產物。它既克服了 RFLP 技術複雜、有放射性危害和 RAPD穩定性差，標記呈現隱性遺傳的缺點，同時又兼有二者之長。近幾年來，人們不斷將這一技術完善、發展，使得 AFLP 迅速成為迄今為止最有效的分子。
AFLP原理
[編輯]AFLP也是通過限制性內切酶片段的不同長度檢測DNA多態性的一種DNA分子標記技術。但AFLP是通過PCR反應先把酶切片段擴增，然後把擴增的酶切 片段在高解析度的順序分析膠上進行電泳，多態性即以擴增片段的長度不同被檢測出來。實驗中酶切片段首先與含有與其共同粘末端的人工接頭連接，連接後的粘末 端順序和接頭順序就作為以後PCR反應的引子結合位點。實驗中，根據需要通過選擇在末端上分別填加了1～3個選擇性核苷的不同引子，可以達到選擇性擴增的 目的。這些選擇性核苷酸使得引子能選擇性地識別具有特異配對順序的內切酶片段，進行結合，導致特異性擴增。
實驗試劑
[編輯]Taq酶、EcoRI/ MseIEcoRI/ MseI接頭、E+A引子M+C引子、T4DNALigaseE和M引子、瓊脂、過硫酸胺、丙烯醯胺、尿素、硝酸銀、甲醯胺、 dNTPs、 二甲苯青、冰醋酸、玻璃矽烷、50bpMark
操作步驟
[編輯]基因組DNA提取和純化
[編輯]參考DNA實驗方法
DNA的純化：用0.8%瓊脂糖凝膠（含EB0.5μg/ml）電泳檢測片段大小，取出其中的1/3已提取的基因組DNA進行純化，首先用TE緩衝液補滿 至總體積50ul，再等體積苯酚/氯仿/異戊醇（25：24：1）、氯仿/異戊醇（24∶1）各抽提一次， 離心吸上清液於Eppendorf管中，加入1/10體積的NaAC和二倍體積預冷的無水乙醇，－20℃放置2h以上，10000g離心10min，用 70%的乙醇漂洗DNA沉澱2次 ，風乾後溶於30μlTE緩衝液中，UV-2401PC（島津）紫外分光光度計檢測A260、A280值並定量，再用0.8%瓊脂糖凝膠（含 EB0.5μg/ml）電泳檢測片段大小。
註：0.1-0.2g組織可用100ul溶液E溶，0.5g組織，溶液E可增加至300ul，此時DNA濃度大約為100ng/ul。
限制性酶切及連接
[編輯]在0.2ml離心管中加入：模板量約為250ng，2.5μl 10×酶切緩衝液， 2.5μl 10×T4DNA連接酶切緩衝液，5U EcoRⅠ， 5U MseⅠ，2U T4連接酶，50pmol MseⅠ接頭，雙蒸水補至25μl。用PE公司PCR擴增儀設定37℃過夜反應後，於65℃20min滅酶活，－20℃保存，作為預擴增模板。
預擴增
[編輯]取3μl酶切連接產物，加入75ng E+A，75ng M+C引子，15mmol/L Mg2+，25mmol/L dNTPs，1U Tag酶，3μl 10×PCR緩衝液，加雙蒸水補至30μl。
反應參數為：94℃90s；94℃30s，56℃1min，72℃1min，30循環；72℃10min（PE公司PCR儀）。反應結束後，用0.8%瓊 脂糖凝膠（含EB0.5μg/ml）電泳檢測擴增產物，取3μl產物釋稀50倍，用作選擇性擴增模板。
選擇性PCR擴增
[編輯]取釋稀後的產物3μl，加入EcoRⅠ選擇性引子、MseⅠ選擇性引子各75ng，15mmol/L Mg2+，25mmol/L dNTPs， 1UTag酶，3μl 10×PCR緩衝液，加雙蒸水補至30μl。
反應參數為：94℃90s；94℃30s，65℃1min，72℃1min，13循環（每循環降0.7℃）；94℃30s， 56℃1min， 72℃1min，25循環；72℃5min（PE公司PCR儀），先用0.8%瓊脂糖凝膠（含EB0.5μg/ml）電泳檢測先擇性擴增產物。
凝膠電泳
[編輯]擴增產物用6%變性聚丙烯醯胺膠（厚度0.5mm）和1×TBE電泳緩衝液電泳分離（BIO-RAD公司測序電泳儀）。拔出梳子，140W恆功率預電泳 30分鐘，溫度達到47～49℃。務必使每個孔清洗出尿素。選擇性擴增產物中加入等體積上樣緩衝液（98%甲醯胺，10mmol/LEDTA，0.25% 二甲苯青，0.25%溴酚藍）94℃變性5min（PE公司PCR儀），結束後迅速置於冰上直到點樣。每個泳道加樣8μl。一開始用100W恆功率電泳約 2分鐘，使樣品迅速集中到孔底部，再調到60W恆功率電泳，溫度保持在43℃左右，至二甲苯青FF至玻璃板2/3處，結束電泳。
銀染
[編輯]固定液：取100ml冰醋酸到900ml去離子水或雙蒸水中。染色液：1g AgNO3 ，1.5ml 37% 甲醛，加去離子水至1L。顯色液：30g Na2CO3，1.5ml 37% 甲醛，2mg硫代硫酸鈉，加去離子水至1L。
- 電泳完畢後，將粘有凝膠的玻璃板置入用於銀染的塑料盤中。
- 固定：加入固定液，在搖床上輕微震盪30min。固定結束後，固定液保留。
- 加入去離子水漂洗3次，每次2min。
- 染色：將凝膠放入染色盤中，倒入染色液（4℃），在搖床上輕微震盪30min。用去離子水漂洗凝膠10秒鐘後，置入顯色盤中。
- 顯色：加入顯色液（4℃），在搖床上輕微震盪直至條帶數不再增加為止。
- 終止：加入b步驟用後的固定液，來回漂幾分鐘。達到最好效果後，用蒸餾水漂洗幾分鐘。
- 去除凝膠和玻璃板上的水珠後，放在白光燈箱上用Nikon數位相機拍照。