生物化學與分子生物學/PCR實驗技術/PCR基本原理

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普通PCR[編輯]

概述[編輯]

聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction),簡稱PCR,是一種分子生物學技術,用於放大特定的DNA片段。可看作生物體外的特殊DNA複製。DNA聚合酶(DNA polymerase I)最早於1955年發現,而較具有實驗價值及實用性的Klenow fragment of E. Coli 則是於70年代的初期由Dr. H. Klenow 所發現,但由於此酶不耐高溫,高溫能使之變性, 因此不符合使用高溫變性的聚合酶鏈式反應。現今所使用的酶(簡稱Taq polymerase), 則是於1976年從溫泉中的細菌(Thermus aquaticus)分離出來的。它的特性就在於能耐高溫,是一個很理想的酶,但它被廣泛運用則於80年代之後。PCR最初的原始雛形概念是類似基因修復複製,它是於1971年由 Dr. Kjell Kleppe 提出。他發表了第一個單純且短暫性基因複製(類似PCR前兩個周期反應)的實驗。而現今所發展出來的PCR則於1983由 Dr. Kary B. Mullis發展出的,Dr. Mullis當年服務於PE公司,因此PE公司在PCR界有著特殊的地位。Dr. Mullis 並於1985年與Saiki 等人正式發表了第一篇相關的論文。此後,PCR的運用一日千里,相關的論文發表質量可以說是令眾多其它研究方法難望其項背。隨後PCR技術在生物科研和臨床應用中得以廣泛應用,成為分子生物學研究的最重要技術。Mullis也因此獲得了1993年諾貝爾化學獎。

PCR原理[編輯]

PCR技術的基本原理類似於DNA的天然複製過程,其特異性依賴於與靶序列兩端互補的寡核苷酸引子。PCR由變性--退火--延伸三個基本反應步驟構成:

①模板DNA的變性:模板DNA經加熱至93℃左右一定時間後,使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引子結合,為下輪反應作準備;

②模板DNA與引子的退火(復性):模板DNA經加熱變性成單鏈後,溫度降至55℃左右,引子與模板DNA單鏈的互補序列配對結合;

③引子的延伸:DNA模板--引子結合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP為反應原料,靶序列為模板,按鹼基互補配對與半保留複製原理,合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留複製鏈,重複循環變性--退火--延伸三過程就可獲得更多的「半保留複製鏈」,而且這種新鏈又可成為下次循環的模板。

每完成一個循環需2~4分鐘,2~3小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。

PCR反應體系與反應條件[編輯]

標準的PCR反應體系
試劑 用量
10×擴增緩衝液 10μl
4種dNTP混合物 200μl
引子 10~100μl
模板DNA 0.1~2μg
Taq DNA聚合酶 2.5 μl
Mg2+ 1.5m mol/l
加雙或三蒸水 100 μl

PCR反應五要素[編輯]

參加PCR反應的物質主要有五種即引子(PCR引子為DNA片段,細胞內DNA複製的引子為一段RNA鏈)、酶、dNTP、模板和緩衝液(其中需要Mg2+)。

標準的PCR過程分為三步:

  1. DNA變性(90℃-96℃):雙鏈DNA模板在熱作用下, 氫鍵斷裂,形成單鏈DNA
  2. 退火(25℃-65℃):系統溫度降低,引子與DNA模板結合,形成局部雙鏈。
  3. 延伸(70℃-75℃):在Taq酶(在72℃左右,活性最佳)的作用下,以dNTP為原料,從引子的5′端→3′端延伸,合成與模板互補的DNA鏈。

每一循環經過變性、退火和延伸,DNA含量即增加一倍。現在有些PCR因為擴增區很短,即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的時間內複製完成,因此可以改為兩步法,即退火和延伸同時在60℃-65℃間進行,以減少一次升降溫過程,提高了反應速度。

PCR反應特點[編輯]

特異性強[編輯]

PCR反應的特異性決定因素為:

①引子與模板DNA特異正確的結合;

②鹼基配對原則;

③Taq DNA聚合酶合成反應的忠實性;

④靶基因的特異性與保守性。

其中引子與模板的正確結合是關鍵。引子與模板的結合及引子鏈的延伸是遵循鹼基配對原則的。聚合酶合成反應的忠實性及Taq DNA聚合酶耐高溫性,使反應中模板與引子的結合(復性)可以在較高的溫度下進行,結合的特異性大大增加,被擴增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區,其特異性程度就更高。

靈敏度高[編輯]

PCR產物的生成量是以指數方式增加的,能將皮克(pg=10-12)量級的起始待測模板擴增到微克(μg=-6)水平。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞;在病毒的檢測中,PCR的靈敏度可達3個RFU(空斑形成單位);在細菌學中最小檢出率為3個細菌。

簡便、快速[編輯]

PCR反應用耐高溫的Taq DNA聚合酶,一次性地將反應液加好後,即在DNA擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應,一般在2~4 小時完成擴增反應。擴增產物一般用電泳分析,不一定要用同位素,無放射性污染、易推廣。

對標本的純度要求低[編輯]

不需要分離病毒或細菌及培養細胞,DNA 粗製品及RNA均可作為擴增模板。可直接用臨床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛髮、細胞、活組織等DNA擴增檢測。

PCR常見問題[編輯]

假陰性,不出現擴增條帶[編輯]

PCR反應的關鍵環節有①模板核酸的製備,②引子的質量與特異性,③酶的質量及, ④PCR循環條件。尋找原因亦應針對上述環節進行分析研究。

模板:①模板中含有雜蛋白質,②模板中含有Taq酶抑制劑,③模板中蛋白質沒有消 化除淨,特別是染色體中的組蛋白,④在提取製備模板時丟失過多,或吸入酚。⑤模板核酸變性不徹底。在酶和引子質量好時,不出現擴增帶,極有可能是標本的消化處 理,模板核酸提取過程出了毛病,因而要配製有效而穩定的消化處理液,其程序亦應 固定不宜隨意更改。

酶失活:需更換新酶,或新舊兩種酶同時使用,以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。

引子:引子質量、引子的濃度、兩條引子的濃度是否對稱,是PCR失敗或擴增條帶不 理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引子合成質量有問題,兩條引子一條濃度 高,一條濃度低,造成低效率的不對稱擴增,對策為:①選定一個好的引子合成單 位。②引子的濃度不僅要看OD值,更要注重引子原液做瓊脂糖凝膠電泳,一定要有引子條帶出現,而且兩引子帶的亮度應大體一致,如一條引子有條帶,一條引子無條帶,此時做PCR有可能失敗,應和引子合成單位協商解決。如一條引子亮度高,一條亮度低,在稀釋引子時要平衡其濃度。③引子應高濃度小量分裝保存,防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分,導致引子變質降解失效。④引子設計不合理,如引子長度不夠,引子之間形成二聚體等。

Mg2+濃度:Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大,濃度過高可降低PCR擴增的特 異性,濃度過低則影響PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。

反應體積的改變:通常進行PCR擴增採用的體積為20ul、30ul、50ul。或100ul,應用多 大體積進行PCR擴增,是根據科研和臨床檢測不同目的而設定,在做小體積如20ul 後,再做大體積時,一定要模索條件,否則容易失敗。

物理原因:變性對PCR擴增來說相當重要,如變性溫度低,變性時間短,極有可能出現假陰性;退火溫度過低,可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引子與模板的結合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計,檢測一下擴增儀或水溶鍋內的變性、退火和延伸溫度,這也是PCR失敗的原因之一。

靶序列變異:如靶序列發生突變或缺失,影響引子與模板特異性結合,或因靶序列某 段缺失使引子與模板失去互補序列,其PCR擴增是不會成功的。

假陽性[編輯]

出現的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致,有時其條帶更整齊,亮度更高。

引子設計不合適:選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性,因而在進行PCR擴增時,擴增出的PCR產物為非目的性的序列。靶序列太短或引子太短,容易出現假陽性。需重新設計引子。

靶序列或擴增產物的交叉污染:這種污染有兩種原因:一是整個基因組或大片段的交叉污染,導致假陽性。這種假陽性可用以下方法解決:操作時應小心輕柔,防止將靶序列吸入加樣槍內或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質外,所有試劑或器材均應高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應一次性使用。必要時,在加標本前,反應管和試劑用紫外線照射,以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染,這些小片段比靶序列短,但有一定的同源性。可互相拼接,與引子互補後,可擴增出PCR產物,而導致假陽性的產生,可用巢式PCR方法來減輕或消除。

出現非特異性擴增帶[編輯]

PCR擴增後出現的條帶與預計的大小不一致,或大或小,或者同時出現特異性擴增帶 與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現,其原因:一是引子與靶序列不完全互補、 或引子聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低,及PCR循環次數 過多有關。其次是酶的質和量,往往一些來源的酶易出現非特異條帶而另一來源的酶 則不出現,酶量過多有時也會出現非特異性擴增。其對策有:必要時重新設計引 物。減低酶量或調換另一來源的酶。降低引子量,適當增加模板量,減少循環次 數。適當提高退火溫度或採用二溫度點法(93℃變性,65℃左右退火與延伸)。

出現片狀拖帶或塗抹帶[編輯]

PCR擴增有時出現塗抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由於酶量過多或酶的質量 差,dNTP濃度過高,Mg2+濃度過高,退火溫度過低,循環次數過多引起。其對策有:減少酶量,或調換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。適當降低Mg2+濃度。增加模板量,減少循環次數。

原位PCR[編輯]

在科學研究中,每一項新技術的創立都會帶來一系列新的研究成果問世,從而推動著各學科的發展。縱觀形態研究領域,50年代電子顯微鏡引入形態學觀察領域,帶來了從細胞水平到亞細胞水平的深入研究;60-70年代,免疫組織化學與免疫細胞化學技術的廣泛應用,又將觀察的水平由亞細胞結構推向了蛋白質分子水平,使細胞內眾多的活性物質得以進行細胞或亞細胞水平的定位,對醫學生物學的發展無疑產生了深刻的影響。70年代,分子生物學技術在形態學中的廣泛應用,隨著原位雜交技術的出現,使組織細胞內特定的DNA或RNA序列能夠被定位,將蛋白質水平又提高到基因水平即核酸分子的觀察和定位,從而使人類對許多生命現象在基因水平上的認識得以深化;80年代,分子生物學領域中一項具有強大生命力的技術PCR——多聚酶鏈反應技術問世了,很快地就被引入形態學觀察的領域,使細胞內低拷貝或單拷貝的特定DNA或RNA得以進行定位及觀察。這一技術的問世,必將帶來更多的研究成果,使形態學的研究又向前邁出一大步。

基本原理[編輯]

原位PCR技術的基本原理,就是將PCR技術的高效擴增與原位雜交的細胞定位結合起來,從而在組織細胞原位檢測單拷貝或低拷貝的特定的DNA或RNA序列。

PCR技術是在DNA聚合酶的作用下,經過模板的變性、退火和引子延伸三種循環,將引子引導下的特異性靶序列迅速地進行擴增,經過擴增的靶序列(一般能擴增106倍),很容易在凝膠電泳或Southern印記雜交中顯示出來,因此,PCR技術具有靈敏度高,特異性強的優勢,隨著熱循環自動化的提高與穩定也使得PCR技術的操作簡便易行。但是,PCR技術是在液相中進行的,在擴增前,需將細胞破壞,從中提取核酸作為模板,因此很難將PCR的結果與組織細胞的形態結構聯繫起來,同時,也很難判斷含特異性靶序列的細胞類型。

原位PCR技術成功地將PCR技術和原位雜交技術結合起來,保持了兩項技術的優勢又彌補了各自的不足。原位PCR技術的待檢標本一般先經化學固定,以保持組織細胞的良好形態結構。細胞膜和核膜均具有一定的通透性,當進行PCR擴增時,各種成分,如引子,DNA聚合酶,核苷酸等均可進入細胞內或細胞核內,以固定在細胞內或細胞核內的RNA或DNA為模板,於原位進行擴增。擴增的產物一般分子較大,或互相交織,不易穿過細胞膜或在膜內外彌散,從而被保留在原位。這樣原有的細胞內單拷貝或低拷貝的特定DNA或RNA序列在原位以呈指數極擴增,擴增的產物就很容易被原位雜交技術檢查。

基本類型[編輯]

根據在擴增反應中所用的三磷酸核苷原料或引子是否標記,原位PCR技術可分為直接法和間接法兩大類,此外,還有反轉錄原位PCR技術等。

直接法原位PCR技術[編輯]

直接法原位PCR技術是將擴增的產物直接攜帶標記分子,即使用標記的三磷酸腺苷或引子片斷。當標本進行PCR擴增時,標記的分子就摻入到擴增的產物中,顯示標記物,就能將特定的DNA或RNA在標本(原位)中顯現出來。

常用的標記物有放射性同位素35S,生物素和地高辛,用放射性自顯影的方法或用親和組織化學及免疫組織化學的方法去顯示標記物所在位置。

直接法原位PCR技術的優點是操作簡便,流程短,省時。缺點是特異性較差,易出現假陽性,擴增效率也較低,特別是在石蠟切片上,上述缺點更為突出。因為在製片過程中,無論是固定,脫水還是包埋,都會導致DNA的損害,而受損的DNA可利用反應體系中的標記三磷酸核苷進行修復,這樣標記物就會摻入到DNA的非靶序列中,造成假陽性。若用標記引子的方法進行直接法原位PCR,其擴增的效率比不標記更低。

間接法原位PCR技術[編輯]

間接法原位PCR技術師現在細胞內進行特定DNA或RNA擴增,再用標記的探針進行原位雜交,明顯提高了特異性,是目前應用最為廣泛的原位PCR技術。

間接法原位PCR與直接法不同的是,反應體系與常規PCR相同,所用的引子或三磷酸腺苷均不帶任何標記物。即實現先擴增的目的,然後用原位雜交技術去檢測細胞內已擴增的特定的DNA產物,因此,實際上是將PCR技術和原位雜交技術結合起來的一種新技術,故又稱之為PCR原位雜交(PCR in situ hybridization , PISH)。

間接法PCR技術的優點是特異性較高,擴增效率也較高。缺點是操作步驟較直接法繁瑣。

原位反轉錄PCR技術[編輯]

原位反轉錄PCR(in situ reverse transcription PCR, In Situ RT-PCR)是將液相的RT-PCR技術應用到組織細胞標本中的一種新技術,與RT-PCR(液相)不同點在於,進行原位反轉錄PCR反應之前,組織標本要先用DNA酶處理,以破壞組織中的DNA酶,這樣才能保證擴增的模板是從mRNA反轉錄合成的cDNA,而不是細胞中原有的DNA。其它基本步驟與液相的RT-PCR相似。

基本步驟[編輯]

原位PCR技術的基本步驟包括標本的製備。原位擴增(PCR)及原位檢測等基本環節,現分述如下(重點以石蠟切片為例)。

標本的製備[編輯]

原位PCR技術可應用於細胞懸液、細胞塗片、冰凍切片以及石蠟切片。相比較而言,以懸浮的完整細胞做原位PCR效果最好,石蠟切片效果最差。隨著技術方面的一些問題被解決,近年也有從石蠟切片中得到滿意的PCR效率的報導。效果不好的原因是多方面的,如:玻片上做PCR,熱傳導較差,熱對流不均勻,TaqDNA酶被玻璃片吸附等,更為主要的原因,可能是標本經製片後,細胞缺乏完整的胞漿或核膜,擴增產物易發生瀰漫而導致擴增的產物在原位不易保留。絕大多數的病理標本都是以福馬林固定,石蠟包埋的形式保存的,若能很好地解決石蠟切片原位PCR的有關技術問題,意義顯然是十分重大的。

組織細胞的固定[編輯]

一般認為組織細胞以10%的緩衝福馬林或4%的多聚甲醛固定後進行原位PCR效果較好。固定的時間一般不宜過長,視組織的大小,一般以4℃4-6小時為宜。

切片的厚度[編輯]

一般而言,切片若厚一些,原位PCR的效果也較好一些,因為切片越厚,靶DNA的含量也就越多,同時膜結構也較多,防止擴增產物彌散的作用也越明顯。但厚切片細胞重疊多,形態學觀察的效果就差了,解析度也將下降。

玻片的處理[編輯]

為防止石蠟切片在PCR和原位雜交過程中脫落,在玻片應作防脫片處理,常用的方法是塗以多聚賴氨酸或用矽烷化處理,一般能防止組織脫落。

蛋白酶的消化作用[編輯]

在進行原位擴增之前,組織標本需經蛋白酶處理。經蛋白酶消化的組織細胞,可增加其通透性,充分允許反應體系中的各成分進入細胞內,並能很好的暴露靶序列,以利於擴增。常用的蛋白酶有蛋白酶K,胰蛋白酶或胃蛋白酶。蛋白酶消化的程度就要根據組織固定的程度進行調整。蛋白酶消化後,要注意加熱以滅活酶的活性或通過充分的洗滌將酶完全去除,因為只要有少量的殘留酶存在,都將對隨後進行的PCR反應體系的數量TaqDNA酶產生毀滅性的影響。

蛋白酶消化處理組織細胞可提高通透性,有利於後續進行的各反應成分進入細胞內或核內,但同時也使得擴增產物的彌散機會增多,有可能帶來假陽性或假陰性的結果。

原位擴增(PCR)[編輯]

原位擴增即在組織細胞標本上進行PCR反應,其基本原理與液相PCR完全相同。

引子[編輯]

PCR所用的引子一般為15-30bp為宜,擴增的片斷為100-1000bp左右。原位PCR宜用較短的引子。從石蠟切片中提取的DNA很少超過400bp,RNA很少超過200bp,較長序列的擴增易引起引子與模板的錯配而導致非特異性反應的出現。

反應體系[編輯]

原位PCR的反應體系與常規的液相PCR基本相同,由於是在經過固定的組織切片上進行,為獲得較好的擴增效果,有人主張反應體系中的引子,TaqDNA聚合酶以及Mg2+的濃度均應高於液相的PCR反應體系。在反應體系中要加入牛血清白蛋白(BSA),以防止TaqDNA聚合酶與玻片的結合而降低了擴增效率。

熱循環[編輯]

原位PCR的熱循環可在專門的熱循環儀上進行,操作簡便。也可在一般的PCR熱循環儀上進行,通常在樣品台上覆蓋一層鋁箔,製成平台,樣品台上的空間用礦物油或水充填,將載玻片至於平台上,即可進行熱循環的步驟。

為了保證進行充分的擴增,原位PCR熱循環中每一步驟的時間可比常規PCR略長些,另外,也可採用熱啟動(hot start)的方法,即玻片加熱到80-94℃時,再立即加入TaqDNA聚合酶。

為了保證反應體系在熱循環過程不過多丟失,可用清亮的指甲油,礦物油或PAP筆把蓋片四周封閉起來。

洗滌[編輯]

原位擴增結束後,標本應清洗,以除去彌散到細胞外的擴增產物。洗滌不充分,會導致擴增產物在檢測時顯現,造成背景過深或假陽性結果的出現。但是,洗滌過度,也會造成細胞內擴增的產物被洗脫,是陽性信號減弱或丟失。

有在擴增後用4%多聚甲醛2小時或2%戊二醛5分鐘進行後固定,以使擴增的產物在檢測時能很好地保留在細胞內,提高檢測的敏感性和特異性。

原位檢測[編輯]

原位PCR的擴增產物檢測方法,取決於原位PCR的設計方案,直接法則根據標記分子的性質對擴增產物直接進行原位檢測。間接法則需用原位雜交的方法進行檢測。

原位PCR技術的應用[編輯]

原位PCR技術的突出優勢,就是能在組織細胞原位檢測出拷貝數較低的特異性基因序列。按照待測基因的性質,可將原位PCR的應用分為檢測外源性基因和內源性基因兩方面。

用於外源性基因的檢測[編輯]

病毒基因的檢測[編輯]

感染病毒的細胞常無較好的檢測手段,但當原位PCR技術應用後,使這一極為困難的問題有望解決。

對HIV、HPV、HSV、HBV、HCV等多種病毒的檢測,使我們能夠成功等觀察到這些病毒在愛滋病、生殖系統腫瘤、肝炎及肝癌中的作用,能夠及時發現受感染的人群。

細菌基因的檢測[編輯]

最突出的應用是在結核桿菌的檢測上,當結核病變不夠典型時,經過特殊染色的方法很難在鏡下找到結核桿菌,而應用原位PCR技術可幫助明確診斷,當結核桿菌很少時仍能在鏡下被很容易地找出來。

導入基因的檢測[編輯]

在轉基因動物的研究中,是否導入了基因,在接受基因治療的患者體內,是否接受了導入的基因,均可用原位PCR技術來證實。因此,原位PCR技術成為重要的檢測手段。

用於內源性基因的檢測[編輯]

異常基因的檢測[編輯]

機體內基因的突變、重排、也可用原位PCR技術進行檢測,原癌基因,抑癌基因的突變,惡性淋巴瘤免疫球蛋白重鏈基因的重排,對腫瘤的研究和診斷無一均提供了廣闊的應用前景。

固有基因的檢測[編輯]

對於機體細胞內只有單個或幾個拷貝的低表達固有基因,原位雜交技術因基因拷貝數太少而無能為力,液相PCR雖可進行擴增檢測出來,但不能確定含有該基因的細胞類型,原位PCR技術則彌補了上述兩種技術的不足,使得我們能夠對人類各種基因進行檢測,而完成人類基因圖的繪製。

反向PCR[編輯]

反向PCR(reverse PCR)是用反向的互補引子來擴增兩引子以外的未知序列的片段,而常規PCR擴增的是已知序列的兩引子之間DNA片段.實驗時選擇已知序列內部沒有切點的限制性內切酶對該段DNA進行酶切,然後用連接酶使帶有粘性末端的靶序列環化連接,再用一對反向的引子進行PCR,其擴增產物將含有兩引子外未知序列,從而對未知序進行分析研究。

反向PCR的目的在於擴增一段已知序列旁側的DNA,也就是說這一反應體系不是在一對引子之間而是在引子外側合成DNA。反向PCR可用於研究與已知DNA區段相連接的未知染色體序列,因此又可稱為染色體緩移或染色體步移。這時選擇的引子雖然與核心DNA區兩末端序列互補,但兩引子3』端是相互反向的。擴增前先用限制性內切酶酶切樣品DNA,然後用DNA連接酶連接成一個環狀DNA分子,通過反向PCR擴增引子的上游片段和下游片段;現已製備了酵母人工染色體(YAC)大的線狀DNA片段的雜交探針,這對於轉座子插入序列的確定和基因庫染色體上DNA片段序列的識別十分重要。

PCR只能擴增兩端序列已知的基因片段,反向PCR可擴增中間一段已知序列,而兩端序列未知的基因片段不擴增。

反向PCR的目的在於擴增一段已知序列旁側的DNA,也就是說這一反應體系不是在一對引子之間而是在引子外側合成DNA。反向PCR可用於研究與已知DNA區段相連接的未知染色體序列,因此又可稱為染色體緩移或染色體步移。這時選擇的引子雖然與核心DNA區兩末端序列互補,但兩引子3』端是相互反向的。擴增前先用限制性內切酶酶切樣品DNA,然後用DNA連接酶連接成一個環狀DNA分子,通過反向PCR擴增引子的上游片段和下游片段;現已製備了酵母人工染色體(YAC)大的線狀DNA片段的雜交探針,這對於轉座子插入序列的確定和基因庫染色體上DNA片段序列的識別十分重要。

該方法的不足是:①需要從許多酶中選擇限制酶,或者說必須選擇一種合適的酶進行酶切才能得到合理大小的DNA片段。這種選擇不能在非酶切位點切斷靶DNA。②大多數有核基因組含有大量中度和高度重複序列,而在YAC或Cosmid中的未知功能序列中有時也會有這些序列,這樣,通過反向PCR得到的探針就有可能與多個基因序列雜交。

利用反向PCR可對未知序列擴增後進行分析,探索鄰接已知DNA片段的序列,並可將僅知部分序列的全長cDNA進行分子克隆,建立全長的DNA探針。適用於基因遊走、轉位因子和已知序列DNA旁側病毒整合位點分析等研究。

用傳統的緩衝液和其他提供者推薦的條件裂解DNA。反向PCR所擴增的片段的大小由 PCR擴增片段的大小決定,目前,PCR擴增的實際上限為3-4kb。在許多情況下,首先 需要進行Southern雜交來確定內切酶用以產生大小適於環化及反向PCR的片段的末端 片段。能裂解核心區的內切酶使反向PCR只能擴增引子所定模板(依賴於引子)的上游 或上游區,而不裂解核心區的酶則使兩上邊側序列都擴增,並帶有由內切酶和環化類 型決定的接點(例如,互補突頭連接與鈍頭連接)。對於擴增左翼或右翼序列,初試時 最好靠近識別上個鹼基位位的酶,並已知在核心區有其方便的裂解位點。如果用反向 PCR從含有大量不同的克隆片段的同一載體中探測雜交探針,建議事先在載體中引入 合適的酶切位點。

用T4連接酶在稀DNA濃度下環化更容易形成單環。在一些實驗中,為產生對反向 PCR大小適當的DNA片段需要兩種內切酶,但這樣所產生的片段末端則不適於連接,環 化前需用Klenow或噬菌體T4DNA聚合酶修理(鈍化)。連接前,需用酚或熱變性使內切 酶失活。

聚合酶鏈反應條件與經典所用的相同,例如,94℃-30秒變性,58℃-30秒引子退火, Taq聚合酶70℃延伸3分鐘,進行30個循環。可改變PCR條件以生產特異產物。將反向 PCR用於測序時,與核心區末端後部結合的擴增引子更為有用,它使測序引子擴增部 分的核心序列與未知邊側序列間的接點更近,減少了擴增引子的干擾。

描述一種大聚合酶鏈反應應用的方法,使在已知序列的核心區邊側的未知 成幾何級數擴增用適當的限制性內切裂解含核心區的,以產生適合於擴 增大小的片段,然後片段的末端再連接形成環狀分子的引子同源於環上核心區 的末端序列,但其方向性,使鏈的延長經過環上的未知區而不是分開引子的核心區 這種反向方法可用於擴增本來就在核心區旁邊的序列,還可應用於製備未知序列 探針或測定邊側區域本身的上下游序列。

逆轉錄PCR[編輯]

RT-PCR 為反轉錄RCR(reverse transcription PCR)和實時PCR(real time PCR)共同的縮寫。

逆轉錄PCR,或者稱反轉錄PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR),是聚合酶鏈式反應(PCR)的一種廣泛應用的變形。在RT-PCR中,一條RNA鏈被逆轉錄成為互補DNA,再以此為模板通過PCR進行DNA擴增。

由一條RNA單鏈轉錄為互補DNA(cDNA)稱作「逆轉錄」,由依賴RNA的DNA聚合酶(逆轉錄酶)來完成。隨後,DNA的另一條鏈通過脫氧核苷酸引子和依賴DNA的DNA聚合酶完成,隨每個循環倍增,即通常的PCR。原先的RNA模板被RNA酶 H降解,留下互補DNA。

RT-PCR的指數擴增是一種很靈敏的技術,可以檢測很低拷貝數的RNA。RT-PCR廣泛應用於遺傳病的診斷,並且可以用於定量監測某種RNA的含量。(檢測基因表達的方法,參見Northern Blot法。)

RT-PCR有時候也會指代實時PCR(real-time PCR)。為了與逆轉錄PCR相區別,通常被寫作「定量PCR」(quantitative PCR)或者RTQ-PCR(real-time quantitative PCR)。

實時PCR,屬於定量PCR(Q-PCR)的一種,以一定時間內DNA的增幅量為基礎進行DNA的定量分析。

real time PCR 的定量使用螢光色素,目前有二種方法。一種是在ds DNA中插入特異的螢光色素;另一種使用一種能與增幅DNA序列中特定寡核酸序列相結合的一種螢光探針(probe)。

real time PCR 與 reverse transcription PCR 相結合,能用微量的RNA來找出特定時間、細胞、組織內的特別表達的遺傳基因。這兩種RT PCR的組合又被稱之為「定量RT-PCR(quantitative RT-PCR)」

PCR各步驟的目的[編輯]

  1. 預變性:破壞DNA中可能存在的較難破壞的二級結構。 使DNA充分變性,減少DNA 複雜結構對擴增的影響,以利於引子更好的和模板結合,特別是對於基因組來源的DNA模板,最好不要吝嗇這個步驟。此外,在一些使用熱啟動Taq酶的反應中,還可激活Taq酶,從而使PCR反應得以順利進行。
  2. 變性--退火--延伸循環:
    • 模板DNA的變性:模板DNA經加熱至93℃左右一定時間後,使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離,使之成為單鏈,以便它與引子結合,為下輪反應作準備;
    • 模板DNA與引子的退火(復性):模板DNA經加熱變性成單鏈後,溫度降至55℃左右,引子與模板DNA單鏈的互補序列配對結合;
    • 引子的延伸:DNA模板--引子結合物在TaqDNA聚合酶的作用下,以dNTP為反應原料,靶序列為模板,按鹼基配對與半保留複製原理,合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留複製鏈。
  3. 用PCR儀擴增時,(變性.退火,延伸)循環完成後,繼續72度延伸了10分鐘的原因:
    • 延伸時間取決於待擴增DNA片段的長度。(當然是在反應體系一定的條件下)例如,使用taqDNA聚合酶,72度時的鹼基摻入率為35-100bp/s,因此延伸速率為1kb/min。
    • 根據延伸速率推得,擴增1kb以內的dna片段1min即可,而3-4kb則需要3-4min,依次照推。通常在最後一輪要適當的將延伸時間延長至4-10min,這樣做是使pcr反應完全以提高擴增產量。
    • 繼續72度延伸了10分鐘除了可以使pcr反應完全以提高擴增產量外,還有一個作用是:在用普通taq酶進行PCR擴增時在產物末端加A尾的作用,可以直接用於TA克隆的進行。