細胞生物學/生殖細胞的起源與發生

生殖細胞的起源

在哺乳動物，如小鼠受精後，受精卵經卵裂(cleavage)、桑葚胚(morula)、囊胚(blastocyst)發育形成具有三胚層的原腸胚(gastrula)。囊胚由兩層不同的細胞構成，分別為上胚層(epiblast)和上胚層內面的內細胞團(inner cell mass)。在三胚層形成之前，上胚層中的祖細胞(progenitor cell)群區域化，產生原始生殖細胞(primordial ge1m cell, PGC)。PGC的產生需要產生自內臟內胚層(visceral endoderm)與胚外外胚層(extraembryonic ectoderm)的TGF-β和Wnt等信號轉導途徑的參與。產生的PGC遷移到生殖嵴(genital ridge)(即未來的性腺）。在生殖峭處，PGC分化成為生殖幹細胞(germ stem cell)。生殖幹細胞提供能用於生殖的配子。PGC的遷移和增殖受到周圍體細胞分泌的許多因子（如PRDMl和PRDM14)的控制。
PGC遷移到生殖嵴時，性別決定(sex determination)即開始。人類性分化大致開始於孕後第6周。通常認為分化成為卵巢是默認途徑，因為XY型生殖帷分化成為睪丸是在SRY(sex-determining region on the chromosome Y)基因控制下進行的，而XX型生殖崝沒有SRY基因，因而發育成卵巢。一旦PGC遷移到生殖腺嵴中，性腺即開始發育，性腺的發育受到體細胞產生的許多轉錄因子（如GATA4、FOXL2、LHX9、WTl、WNT4和SFl)的調控。
在哺乳動物，位於胚胎性腺的原始生殖細胞通過有絲分裂增殖並分化為生殖細胞，生殖細胞經歷了兩種類型的分裂，即有絲分裂和減數分裂，最終分化為成熟的配子（精子和卵子）。精子和卵子的形成，稱為配子發生(gametogenesis), 是指二倍體的生殖細胞發育成單倍體的精子或卵子的過程。也可分別稱為精子發生(spermatogenesis)和卵子發生(oogenesis)。

精子的發生

精子由精原細胞發育而來

在胎兒期，睪丸中的生殖細胞並不進入減數分裂，而是停留在G₀/G₁期，直到出生後才繼續增殖，其中一部分遷移到睪丸的生精小管的基底膜(basement membrane)，並轉變為精原細胞(spermatogonium)或精原幹細胞(spermatogonia stem cell)。精原細胞可以通過有絲分裂增殖，並通過減數分裂產生精細胞(spermatid)。這些精細胞通過核凝縮、胞質的減少、頂體和鞭毛的形成，而在功能和形態上成為精子。
人類精子的發生開始於青春期，產生於睪丸的生精小管（即曲細精管），然後遷移到附睪中成熟並排出。生精小管是一種特殊的復層上皮管道，稱這種上皮為生精上皮(germinal epithelium 或serminiferous epithelium)。生精上皮包含兩種類型的生發細胞(germinal cell), 一種是形成精子的生精細胞，自生精小管外表面至腔面分別分布精原細胞、初級精母細胞、次級精母細胞、精子細胞和精子；另一種是起支持、免疫、營養及分泌等功能的支持細胞(sertoli cell), 為精子產生所必需。精原細胞發育為精子的過程稱為精子發生，在人類約為64天，其發生過程可分為增殖期、生長期、成熟期和變形期4個時期。
1、增殖期為精原細胞的有絲分裂 精原細胞位於基膜上，呈圓形，直徑約12μm, 分化程度較低。青春期後，精原細胞開始不斷增殖，可分為A、B兩型。A別精原細胞不斷增殖，一部分保留下來作為幹細胞，穩定精原細胞數量和保持活躍的生精能力；另一部分分化為B型精原細胞，可生長分化為精子。精原細胞細胞核中染色體數目為2倍體(2n), 人精原細胞為46條染色體。
2、生長期的本質是初級精母細胞的形成與發育 B型精原細胞體積增大，形成初級精母細胞，其染色體數目仍為2n。初級精母細胞處於第一次減數分裂期，隨著染色質的變化，可分為細線期(leptotene)偶線期(zygotene)及粗線期(pachytene)精母細胞。粗線期精母細胞的體積可達到細線期的兩倍以上。第一次減數分裂的時間較長，在人可達22天，分裂後形成次級精母細胞。
3、成熟期為精母細胞的減數分裂期 初級精母細胞形成後，迅速進入減數分裂Ⅰ(即第一次分裂），形成2個次級精母細胞(secondary spermatocyte)。次級精母細胞存在的時間較短，很快完成減數分裂Ⅱ(即第二次分裂），最終形成4個精細胞。上述兩次分裂，只在第一次分裂中染色體複製一次，而細胞卻分裂兩次，結果形成的4個精子細胞中染色體數目都減少一半，由2n變為n。人的精細胞有23條染色體(n)。
4、變形期的本質是精細胞特化為成熟的精子 精細胞位於生精小管的近腔面，體積更小，細胞呈圓形（稱為圓形精子，round spermatid) , 細胞不再分裂，經複雜的變態發育後形成精子(elongating spermatid) , 其過程如下：
(1)頂體形成：精細胞的高爾基複合體經過變化形成一個囊泡，稱為頂體損泡。頂體囊泡與核膜相粘並增大，變為半球狀覆蓋於核前面，不斷增大呈帽狀，套於核前2/3形成頂體(acrosome)。頂體中含有透明質酸酶、酸性磷酸酶、神經氨酸苷酶及蛋白酶等。頂體具有類似溶酶體的功能，在受精時頂體釋放這些酶，消化卵表面的透明帶，形成通道，有助於精子穿過透明帶進入卵子細胞內。
(2)中心粒的變化：中心粒移至頂體的對側，近側中心粒保留，遠側中心粒形成軸絲，頸部的外面由漏斗狀結構包裹，涌斗的擴大部分固著於核的尾端，而另一端則與精子尾部的中段相連。在軸絲的外側出現與之平行的9條外周緻密纖維，構成主段的纖維鞘。哺乳類動物的遠側中心粒一般在身部形成後將消失。
(3)線粒體改變：精子細胞的線粒體體積變小並伸長，且遷移到終端，圍繞著中央軸絲形成螺旋狀排列的線粒體鞘。線粒體鞘為鞭毛運動提供能量，使精子得以快速運動。
(4) 細胞核的特化：精子細胞由圓形變為長形，細胞核變為扁平梨形。精子生成過程的早期，DNA與組蛋白結合，但是隨後大部分精子中的組蛋白被精蛋白(protamine)所取代，使得染色質以一種特殊的方式包裝，濃縮形成精子頭部。精蛋白與DNA的結合也抑制了DNA的表達，增加了抗機械損傷的能力。精子在生成過程中，組蛋白被替代是逐步進行的，首先是睪丸特異的組蛋白變異體取代正常的組蛋白，然後轉變蛋白(transition protein)取代組蛋白變異體。最後，精蛋白取代了轉變蛋白。受精後，精子中的精蛋白被卵子中的組蛋白重新取代。精蛋白或轉變蛋白的缺陷會導致小鼠精子不育或增加不育性。
(5)尾部形成：構成尾部全長軸心是軸絲，來自位於細胞核後端的基體(basal body), 由「9+2」排列的微管組成，隨細胞變長相應伸長。細胞質向尾部匯集並脫落，精子細胞從圓形變為蝌蚪狀精子。
精子包括兩個形態與功能不同的區域，即頭和鞭毛（頭和鞭毛連接處特稱為頸部），這些區域均為質膜所包裹。頭部(head)含有凝縮的單倍體細胞核，被稱為頂體(acrosome)的毅泡所包裂，頂體來自高爾基複合體，含有穿透卵外被的蛋白水解酶；鞭毛(flagellum)區域又可細分為中段、主段和端部。中段(body)含有中心粒，富含線粒體，中心粒可作為產生鞭毛的基體，而線粒體產生鞭毛運動所需要的能量。

多種因子影響精子的發生

精子發生是一個高度複雜的細胞分化調節過程，受到諸多因素的影響。一般而言，這些因素可分為外源性的和內源性的。外源性因素主要包括內分泌、旁分泌和自分泌因子的調控，而內源性因素主要是指生精細胞內基因水平的調控。
1、分泌因子的調控 支持細胞、睪丸間質(Leydig)細胞、生殖細胞以及周圍的其他細胞分泌的因子都參與了精子的發生。睪丸生成睪酮(testosterone)和精子。下丘腦和垂體以及睪丸本身所產生的激素調節睪酮和精子的產生。
下丘腦分泌的促性腺素釋放因子(gonadotropin-releasing hormone, GnRH)通過垂體刺激促黃體素(luteinizing hormone, LH)和促卵泡激素(follicle stimulating hormone, FSH)的產生，LH通過血液運輸到睪丸，並在睪丸處刺激間質細胞產生睪酮（作為雄激素），睪酮也可環化雌激素。睪酮也可反饋下丘腦和垂體，抑制GnRH等的產生。雄激素和FSH 也可以對支持細胞產生效應，形成最適的精子發生環境。
2、基因的調控 從分子水平上來看，精子的發生和成熟分化過程是一系列特定基因程序性表達的結果。近年來發現越來越多的基因參與了精子發生的調控。參與調控的有轉錄因子基因、細胞周期相關基因、原癌基因、凋亡及自噬相關基因、熱休克蛋白基因、細胞骨架蛋白基因、核蛋白轉型相關基因等。涉及基因的轉錄凋控、前體RNA剪切及翻譯水平的調控、蛋白質的穩定性調控（如泛素化）等。人類Y染色體上存在一些精子發生所必需的基因，如AZF(azoospermia factor)DNA 序列，可亞分為AZFa、AZFb、AZFc和AZFd四個區域，這四個區域包含至少12個基因。AZFa 區域DNA長度為400～600kb, 該區域的缺失導致精子發生阻滯在青春期前階段，表現為唯支持細胞症候群(Sertoli-cell-only syndrome)和小睪丸；AZFb區域DNA長度為l～3Mb, 其缺失導致精子發生阻滯在減數分裂前或減數分裂期間；AZFc區域DNA長度為3.5Mb, 含有無精子缺失基因(deleted in azoospermia, DAZ)家族。又如，Piwi蛋白家族通常在睪丸中表達，它們在小鼠精子形成中起重要作用。Piwi蛋白家族成員包括MILl,MIWI和MIWI2, 任一成員基因的剔除都將通過凋亡的增加而導致生殖細胞的喪失。MILI在精子發生的早期階段表達，即從精原細胞的有絲分裂到初級精母細胞減數分裂的粗線期，缺失MILi的小鼠則停止在粗線期；MIWI的表達則要晚一些，從粗線期到圓形精細胞期，基因敲除MIWI的小鼠會導致精子發生停止在圓形精細胞期。而基因敲除MIWI2的小鼠表現為減數分裂早期的缺陷。
DNA甲基化、miRNA和組蛋白-精蛋白轉變對精子的發生也有重要的作用。例如，生殖細胞的調節基因DAZL在不育精子中甲基化缺陷增加；miR-19b和let-7a在不育的精子中表達要高於可育的精子；MTHFR、PAXB、NTF3和SFN等基因啟動子處的超甲基化也與精子的濃度、移動性和形態相關；組蛋白精蛋白替換異常可導致精子中染色質凝縮提前、轉錄停止，甚至不能產生正常的精子。又如piRNA(Piwi-interacting RNA)是一類長度為24～32核苷酸的小RNA, 這些小RNA只有與Piwi蛋白家族成員相結合才能發揮它的調控作用。piRNA主要分布在包括人類等數種動物睪丸的精原細胞內，它們在減數分裂開始時大量積聚，在成熟的精子產物中消失。研究結果提示，piRNA與Piwi共同作用調控生殖幹細胞的自我更新及精子的發育成熟。其主要機制是Piwi-piRNA複合物引起基因沉默、維持基因組穩定。新近研究表明，缺少一種粗線期piRNA(pachytene piwi-interacting RNA) , 精子的發育將受阻。
此外，環境因子影響精子的發生。通常環境因子分為下列類型：雌激素類似物、二噁英、鄰苯二甲酸鹽、多氯化聯（二）苯、娠化合物、多環芳烴、溴系阻燃劑以及重金屬。這些環境因子存在於土壤、空氣和河流，可通過呼吸、身體接觸、食品和飲用水進入入體，通過不同的分子機制，對男性的生殖細胞和精子的產生產生不利的影響，導致精子質量和濃度下降。

卵子的發生

卵子由卵原細胞發育而來、直至受精後才發育成熟

卵原細胞(oogonium)發育為卵子的過程稱為卵子發生，一般可分為增殖期、生長期、成熟期三個時期。
1、增殖期的特點是有絲分裂和卵原細胞的形成 PGC在生殖嵴中，經過多次有絲分裂，成為卵原細胞。卵原細胞通過有絲分裂迅速增殖，在人體中可達到5百萬～7百萬個細胞，但是其中大部分卵原細胞將會死亡，僅留下約5萬個。
2、生長期是初級卵母細胞的再發育 卵原細胞體積增大並進一步發育成初級卵母細胞(primary oocyte), 在這個時期（通常為哺乳動物出生以前），減數分裂Ⅰ開始：DNA進行複製，結果是每條染色體由兩條姊妹染色單體組成，同源染色體沿其長軸配對，配對的非姊妹染色單體之間發生交換。此後，初級卵母細胞停留在減數分裂Ⅰ的分裂前期（前期Ⅰ的雙線期），此期可長達數月（小鼠）或數十年（女性）。在絕大多數哺乳類動物中，LH可誘導卵細胞的最後成熟。此後，初級卵母細胞進一步發育，在細胞內積累大量卵黃、RNA和蛋白質等物質，為受精後的發育提供信息、物質和能蜇的準備，其染色體數仍為二倍體(2n)。
雌性生殖細胞是在卵泡(follicle)中發育成熟的。初級卵母細胞在原始卵泡和生長卵泡內進一步發育。
(1)原始卵泡：原始卵泡(primordial follicle)位於卵巢皮質淺層，體積小，數量多。卵泡中央為初級卵母細胞，周圍為單層扁平的卵泡細胞(follicle cell), 卵泡細胞具有支持和營養卵母細胞的作用。卵泡細胞與卵母細胞之間有許多縫隙連接，縫隙連接有利於卵泡細胞將營養物質輸送給卵母細胞以及進行細胞間離子、激素和小分子物質的交換。
(2)生長卵泡：原始卵泡生長發育轉變為生長卵泡(growing follicle), 卵泡逐漸移至卵巢皮質深層，主要變化是初級卵母細胞體積增大，卵泡細胞和卵泡周圍結締組織增生，生長卵泡可分為初級卵泡和次級卵泡兩個時期：心初級卵泡(primary follicle), 由原始卵泡發育形成。此時初級卵母細胞體積增大，卵泡細胞由單層扁平狀變為立方形或柱狀，隨之細胞增殖成多層(5～6層），卵泡周圍間質細胞密集形成卵泡膜。在初級卵泡早期，卵母細胞和卵泡細胞之間出現一層含糖蛋白的透明帶(zona pellucida)。透明帶由卵泡細胞和初級卵母細胞共同分泌形成的，具有較強的組織特異性和抗原性，能對同種精子進行專一性的識別與結合，從而使受精過程具有相當的物種專一性。透明帶也能保護卵子免於機械損傷。初級卵母細胞還在此時產生含有用於受精的酶和蛋白質的皮質顆粒(cortical granule)。皮質顆粒大小為0.2～O.6μm, 含有含蛋白酶、黏多糖等。②初級卵泡繼續生長成為次級卵泡(secondary follicle)。此時卵泡體積更大，卵泡細胞增至6～12層，細胞間出現一些不規則的腔隙，並逐漸合併成一個半月形的腔，稱為卵泡腔(follicular antrum), 腔內充滿卵泡液，內含透明質酸酶和性激素及營養物質成分。卵泡液是由卵泡細胞分泌液和卵泡膜血管滲出液組成的。
隨著卵泡液的增多及卯泡腔擴大，卵母細胞居於卵泡的一側，並與其周圍的顆粒細胞一起突向卵泡腔，形成卵丘(cumulus oophorus), 此時的卵泡稱為近成熟卵泡(premature follicle)。緊貼透明帶的一層柱狀卵泡細胞呈放射狀排列，稱放射冠(corona radiata)；分布在卵泡腔周邊的卵泡細胞較小，構成卵泡壁，稱為顆粒層(stratum granulosum)。在卵泡生長過程中，卵泡膜分化為內、外兩層。卵泡的生長主要受LH和FSH的影響。
3、成熟期的標誌是次級卵母細胞的形成當卵泡增大至直徑約15～20mm時向卵巢表面突出，即為成熟卵泡(mature follicle)。成熟卵泡的卵泡腔很大，顆粒層甚薄，顆粒細胞也不再增殖。成熟卵泡由卵丘細胞、透明帶、卵周腔和卵子細胞組成。成熟卵泡是卵泡發育的最後階段，通常是在性成熟時期發生的。發育成熟的初級卵母細胞在激素的影響下，細胞開始完成減數分裂Ⅰ，染色體重新凝縮，核被膜裂解，複製的同源染色體在後期1分離，成為兩個子細胞核，每個都包含了原有染色體的一半，但是細胞質不對稱分裂產生兩個在大小上有很大不同的細胞：一個是小的極體(polar body) (即第一極體），另一個是大的次級卵母細胞。在此階段，每個染色體仍然是由兩個姐妹染色單體構成。
在大多數哺乳類動物中，次級卵母細胞緊接著進入減數分裂Ⅱ，並被阻斷在減數分裂Ⅱ的中期，只有在受精後才最終完成減數分裂。人卵巢中的初級卵母細胞大約只有400個能進入成熟期，發育為排卵時停止在減數分裂1I的中期的次級卵母細胞。排卵(ovulation)是指突出於卵巢表面的成熟卵泡發生破裂，包含有卵丘細胞的卵母細胞隨卵泡液排除的過程。每月有1個卵細胞成熟並被排出。
4、次級卵母細胞在受精後完成減數分裂Ⅱ而形成成熟卵子 受精後，次級卵母細胞的姐妹染色單體在減數分裂Ⅱ後期分離之後，大的次級卵母細胞的細胞質再次發生不對稱分裂產生成熟的卵子和一個小的第二極體。極體與卵子一樣，也是單倍體。因在卵細胞發育全過程中，細胞質發生了兩次不對稱分裂，使卵細胞保持了較大的體積。所形成的三個極體（第一極體仍可分裂為2個極體）體積很小，最終將退化消失。
發育成熟的卵子細胞具有顯著特徵：①在其質膜外有一層卵外被(egg coat), 為一種特殊形式的細胞外基質，主要由大量的糖蛋白分子構成。在哺乳動物卵外被即為透明帶；非哺乳動物為卵黃膜。卵外被可以保護卵細胞免受機械損傷，同時又是受精過程中精子的種屬特異性屏障，它只允許物種相近或相同的精子進入卵子細胞。②包括哺乳動物在內，許多卵子細胞在其質膜下靠近胞質外側的區域為皮層(cortex), 是一層5μm厚的膠狀胞質，內含高濃度的肌動蛋白分子和內含特化的分泌囊泡，即皮層顆粒(cortical granule)。皮層顆粒包含有消化酶、黏多糖、黏性糖蛋白和透明蛋白，當卵子被精子激活時，這些皮層顆粒成分通過胞吐作用(exocytosis)被釋放出來，改變卵外被（在哺乳動物為透明帶；非哺乳動物為卵黃膜）的性質，以阻止多精入卵。③成熟卵子中合成了大量的蛋白質、核糖體，以及tRNA和mRNA等，某些mRNA和蛋白質為指導受精卵發育的形態發生因子(morphogenetic factor)，它們通常定位於卵細胞的不同區域，呈極性分布，在卵裂過程中被分離到不同的細胞中去，這些成分在胚胎極性的確定及模式形成中起重要作用。

卵母細胞減數分裂的調控

卵母細胞減數分裂的第一個調控位點在第一次減數分裂雙線期。卵母細胞可以在該期停留很長時間（在人類可以達到50年），其間染色體去凝聚並進行活躍的轉錄，轉錄活性升高可表現為卵母細胞體積明顯增大。例如，人卵母細胞在這一時期的直徑可達到lOOμm，蛙卵母細胞直徑甚至接近1mm。此期中，細胞生長的同時，卵母細胞蓄積大量RNA和蛋白質等支持胚胎早期發育所需要的物質。
不同物種的卵母細胞重新進入減數分裂和受精的發生過程是不同的。某些動物的卵母細胞在受精前一直停留在減數分裂Ⅰ的雙線期，在受精後才完成減數分裂。但是，大多數脊椎動物（包括蛙、鼠和人類）的卵母細胞在受到激素刺激後發生減數分裂的恢復，並在受精前完成第一次減數分裂。接著，產生的次級卵母細胞在沒有重新形成細胞核，染色體也沒有去凝聚的情況下進入第二次減數分裂。然後，大多數脊椎動物卵母細胞又會停滯在減數分裂Ⅱ中期，並維持在這個時期直到受精。
卵母細胞停止在前期Ⅰ是由於MPF活性低造成的，恢復減數分裂需要MPF的活化。MPF由p34^cdc2激酶(CDKl或Cdc2)亞基和周期蛋白Bl所構成。CDKl在G₂/M-期轉變過程中也是必需的。幾種信號轉導途徑能確保停止在前期Ⅰ的卵母細胞中的MPF處於低活性狀態，然後再活化MPF重新進入減數分裂。
在卵母細胞停留在前期Ⅰ時，壁顆粒細胞(mural granulosa cell)產生Nppc，Nppc刺激卵丘顆粒細胞(cumulus granulosa cell)產生鳥苷酸環化酶NPr2，NPr2催化GTP生成cGMP。cGMP通過Cx37縫隙連接進入卵母細胞，防止了PDE3A在卵母細胞中水解cAMP成為5'-腺苷酸。cAMP活化PKA,PKA轉過來活化WeelB激酶，並抑制Cdc25B磷酸酶，WeelB激酶磷酸化CDKl,導致了CDKl的活化，即MPF的活化。APC/C^Cdhl介導周期蛋白Bl (cyclin Bl)連續降解，阻止了MPF在前期Ⅰ停止的卵母細胞中的活化。APC/C^Cdh1(APC/C是一個多亞基的E3泛素連接酶，正向調節蛋白Cdhl是APC/C活化和底物特異性所必需）。前期Ⅰ停止的卵母細胞中可被Emil蛋白抑制。低MPF活性也有利於PPl的活化，PPl可連續地去除減數分裂蛋白的磷酸化。
排卵時LH的增加導致了縫隙連接的關閉，阻止了cGMP進入卵母細胞。從而增加了PDE3A介導的cAMP的水解。低水平的cAMP和PKA不再活化WeelB和Cdc25B，CDKl去磷酸化並活化。活化MPF磷酸化並活化PPl, 這有利於其他CDKl底物處於磷酸化狀態的維持。MPF可磷酸化核纖層蛋白A，從而使核被膜破裂，繼續進行減數分裂。

哺乳動物的精子和卵子在發生上的差異

儘管精子和卵子的發生過程都經歷減數分裂，但在大多數哺乳動物，精子和卵子的產生過程有很大不同，主要表現在：①在發生與成熟的時間上不同，例如，在人類女性，卵原細胞僅在胎兒時期增殖，出生以前就進入了減數分裂Ⅰ期，並且停留在卵母細胞狀態，可以持續50多年。卵細胞按照嚴格的發育程序成熟並定期排卵，基本上從青春期開始第一次排卵，而且排卵後的次級卵母細胞的核仍是二倍的，直到受精後減數分裂才完成；與女性相比，男性精原細胞的減數分裂和精子的形成直到青春期才在睪丸中開始。②在形成成熟生殖細胞的數量上不同，精子發生中的減數分裂，細胞為對稱分裂，產生四個相同的精子細胞；而卵子發生的減數分裂是不對稱的，形成一個卵子和三個極體。