細胞轉染操作方法

轉染，是將外源性基因導入細胞內的一種專門技術。隨著基因與蛋白功能研究的深入，轉染目前已成為實驗室工作中經常涉及的基本方法。轉染大致可分為物理介導、化學介導和生物介導三類途徑。電穿孔法、顯微注射和基因槍屬於通過物理方法將基因導入細胞的範例；化學介導方法很多，如經典的磷酸鈣共沉澱法、脂質體轉染方法、和多種陽離子物質介導的技術；生物介導方法，有較為原始的原生質體轉染，和現在比較多見的各種病毒介導的轉染技術。

理想細胞轉染方法，應該具有轉染效率高、細胞毒性小等優點。病毒介導的轉染技術，是目前轉染效率最高的方法，同時具有細胞毒性很低的優勢。但是，病毒轉染方法的準備程序複雜，常常對細胞類型有很強的選擇性，在一般實驗室中很難普及。其它物理和化學介導的轉染方法，則各有其特點。

需要指出的一點，無論採用哪種轉染技術，要獲得最優的轉染結果，可能都需要對轉染條件進行優化。影響轉染效率的因素很多，從細胞類型、細胞培養條件和細胞生長狀態，到轉染方法的操作細節，都需要考慮。

細胞傳代

試驗準備：200ul/1mlTip頭各一盒(以上物品均需高壓滅菌)，酒精棉球，廢液缸，試管架，微量移液器，記號筆，培養皿，離心管。
棄掉培養皿中的培養基，用1ml的PBS溶液洗滌兩次。
用Tip頭加入1ml Trypsin液，消化1分鐘(37℃，5%CO2 )。用手輕拍培養瓶壁，觀察到細胞完全從壁上脫落下來為止。
加入1ml的含血清培養基終止反應。
用Tip頭多次吹吸，使細胞完全分散開。
將培養液裝入離心管中，1000rpm離心5min。
用培養液重懸細胞，細胞計數後選擇0.8X106個細胞加入一個35mm培養皿。
將合適體積完全培養液加入離心管中，混勻細胞後輕輕加入培養皿中，使其均勻分布。
將培養皿轉入CO2培養箱中培養，第二天轉染。

細胞轉染

1. 轉染試劑的準備

① 將400ul去核酸酶水加入管中，震盪10秒鐘，溶解脂狀物。

② 震盪後將試劑放在－20攝氏度保存，使用前還需震盪。

2. 選擇合適的混合比例(1：1－1：2/脂質體體積：DNA質量)來轉染細胞。在一個轉染管中加入合適體積的無血清培養基。加入合適質量的MyoD或者EGFP的DNA，震盪後在加入合適體積的轉染試劑，再次震盪。

3. 將混合液在室溫放置10―15分鐘。

4. 吸去培養板中的培養基，用PBS或者無血清培養基清洗一次。

5. 加入混合液，將細胞放回培養箱中培養一個小時。

6. 到時後，根據細胞種類決定是否移除混合液，之後加入完全培養基繼續培養24－48小時。

第二次細胞傳代

在轉染後24小時，觀察實驗結果並記錄綠色螢光蛋白表達情況。
再次進行細胞傳代，按照免疫染色合適的密度0.8X105個細胞/35mm培養皿將細胞重新轉入培養皿中。
在正常條件下培養24小時後按照染色要求條件固定。

轉染方法		原理	主要應用	特點
DEAE－葡聚糖法		帶正電的DEAE-葡聚糖與核酸帶負電的磷酸骨架相互作用形成的複合物被細胞內吞	瞬時轉染	相對簡便、重複比磷酸鈣好，但對細胞有一定的毒副作用，轉染時需除血清且一般只用於BSC-1，CV-1，COS細胞系
磷酸鈣法		磷酸鈣DNA複合物吸附細胞膜被細胞內吞	穩定轉染，染瞬轉染	不適用於原代細胞（所需的DNA濃度較高），操作簡便但重複性差，有些細胞不適用細胞建議用CSCL梯度離心，轉染是拷貝數較多
陽離子脂質體法		帶正電的脂質體與核酸帶負電的磷酸基團形成複合物，然後脂質體上剩餘的電核與細胞膜上的唾液酸殘基的負電核結合；另一種解釋是通過細胞是內吞作用而被進入細胞。(若DNA濃度過高，中和脂質體表面電核，而降低了與細胞的結合能力)	穩定轉染，瞬時轉染，所有細胞	使用方法簡單，可攜帶大片段DNA，通用於各種類型的裸露DNA或RNA，能轉染各種類型的細胞，沒有免疫原性。雖在體外基因轉染中有很高的效率，但在體內，能被血清清除，並在肺組織內累積，誘發強烈的抗炎反應，導致高水平的毒性，這在很大程度上限制了其應用
陽離子聚合物		帶正電的聚合物與核酸帶負電的磷酸基團形成帶正電的複合物後與細胞表面帶負電的蛋白多糖相互作用，並通過內吞作用進入細胞。	穩定轉染，瞬時轉染，所有細胞	除了具有陽離子脂質體的轉染效率高，操作簡單，適用範圍廣，重複性好等特點外，還具有在體內，轉染效率高，細胞毒性低等特點，是新一代的轉染試劑。
病毒介導法	逆轉錄病毒(RNA)	通過病毒中膜糖蛋白和宿主細胞表面的受體相互作用而進入宿主細胞，之後反轉入酶啟動合成DNA並隨機整合到宿主基因組中	穩定轉染，特定宿主細胞	可用於難轉染的細胞、原代細胞，體內細胞等，但攜帶基因不能太大（<8kb），細胞需處分裂期，需考慮安全因素
病毒介導法	腺病毒(雙鏈DNA)	先和細胞表面的受體結合，繼而在αv整合素介導下被細胞內吞	瞬時轉染，特定宿主細胞	可用於難轉染的細胞，需考慮安全因素
Biolistic 顆粒傳遞法（基因槍粒子轟擊法）		將DNA用顯微重金屬顆粒沉澱，再將包被好的顆粒用彈道裝置投射入細胞，DNA在胞內逐步釋放，表達	瞬時性轉染，穩定轉染	可用於：人的表皮細胞，纖維原細胞，淋巴細胞系以及原代細胞
顯微注射法		用顯微操作將DNA直接注入靶細胞核	穩定轉染，瞬時轉染	轉染細胞數有限，多用於工程改造或轉基因動物的胚胎細胞
電穿孔法		高脈衝電壓破壞細胞膜電位，DNA通過膜上形成的小孔導入	穩定轉染，瞬時轉染，所有細胞	適用性廣，除了質體外，還可轉染大的基因組（>65kb）但細胞致死率高，DNA和細胞用量大，需根據不同細胞類型優化電穿孔實驗條件，拷貝數較少1-20