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細胞生物學/細胞遷移實驗

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腫瘤藥物5-氟尿嘧啶對腫瘤細胞遷移的影響(細胞劃痕法)[編輯]

實驗導讀[編輯]

瘤組織的增殖失控、瘤細胞的分化異常、瘤細胞具有侵襲和轉移的能力是惡性腫瘤最基本的生物學特徵,而侵襲和轉移又是惡性腫瘤威脅患者健康乃至生命的主要原因。因此研究腫瘤侵襲和轉移的規律及其發生機制,對惡性腫瘤的防治有重要意義。

腫瘤轉移是指惡性腫瘤細胞從原發部位侵入淋巴管、血管或體腔,至靶組織或靶器官,長出與原發瘤不相連續而組織學類型相同的腫瘤。前者稱為原發瘤,後者稱為轉移瘤或繼發瘤。

根據腫瘤異質性理論,大多數惡性腫瘤最初雖屬單克隆起源,但它在不斷增殖演進至臨床明顯的腫瘤時,由於瘤細胞遺傳性狀的不穩定性(來自基因突變或缺失等)而不斷地變異,造成該腫瘤內瘤細胞亞群表型的多樣性,諸如瘤細胞的侵襲性、生長速率、轉移能力,核型乃至對激素的反應性和抗腫瘤藥物的敏感性等,這些瘤細胞亞群具有被此不同的特性即所謂異質性。異質性與腫瘤轉移直接有關的就是癌細胞的轉移潛能,癌細胞的轉移潛能有高低之分,具有高轉移潛能的筋細胞易發生轉移。

腫瘤細胞的運動性,來源於細胞運動「接觸抑制」的概念。通過體外培養正常和惡性結締組織細胞,發現正常纖維母細胞在移動過程中引起的皺棲腦膜與其他細胞的表面接觸時,往往產生細胞膜活動的抑制和移動中細胞的縮短,然後停止。當纖維母細胞生長過程中在培養皿上融合形成一單層時,細胞運動即顯著受到抑制。間變的肉瘤細胞則缺乏接觸抑制,瘤細胞的運動不會被正常纖維母細胞所抑制。

針對腫瘤轉移這一複雜的過程,人們研製了各種抗轉移藥物,如血小板凝集抑制劑、血管生成抑制因子、內皮穩定因子、干擾素-α以及其他化學藥物。

細胞劃痕法是測定了腫瘤細胞的運動特性的方法之一。其借鑑體外細胞致傷癒合實驗模型,在體外培養的單層細胞上,劃痕致傷,然後加入藥物觀察其抑制腫瘤細胞遷移的能力。下圖即為劃痕實驗的示意圖,圖中可見,在細胞層上出現一道空痕(A),當加入藥物後,由於藥物的作用使細胞遷移受到抑制(B),而未加入藥物的細胞保持了原有的遷移能力,在一段時間後通過遷移將劃痕掩蓋(C)。

A                                 B

C

實驗結果(A表示在單層細胞上劃出的一道痕;B表示加入抑制劑,為陽性對照組;C表示未加入抑制劑,為陰性對照組)

實驗目的[編輯]

  1. 了解腫瘤細胞轉移的基本原理
  2. 了解測定細胞運動特性的方法――細胞劃痕法

實驗原理[編輯]

腫瘤細胞在體外仍具有遷移的能力,本實驗借鑑體外細胞致傷癒合實驗模型,利用細胞劃痕法測定了腫瘤細胞的運動特性。

儀器和試劑[編輯]

  1. 細胞系及其培養:肝腫瘤細胞HepG2
  2. 24孔板,移液器,倒置顯微鏡,
  3. 主要試劑:PBS,DMEM培養液,0.25%胰酶,胎牛血清,5-氟尿嘧啶溶液(1ug/ml)

實驗步驟[編輯]

1. 5-氟尿嘧啶溶液的配製

   精密稱取10mg用滅菌蒸餾水溶解,定容於100ml容量瓶,精密移取1ml溶液,稀釋至100ml,即得1ug/ml 5-氟尿嘧啶溶液。

2.製備單層細胞

將細胞密度為5~10×105 個/mL的Hep G2細胞鋪於24孔板(每孔500 uL)上,加入含10%胎牛血清的RMPI.1640 培養液,培養16~24 h,使形成單層細胞。

3.劃痕

以五氟尿嘧啶(5-Fu)為例,首先配製1 μg/μL的母液,取45 μL該母液用PBS稀釋至1.1 mL,得到濃度為40 μg/ML的5-Fu溶液。

用10 uL移液槍槍頭(或者無菌牙籤)在單層細胞上呈「一」字劃痕,用PBS清洗3次,然後加入上面配好的5-Fu溶液,平行兩個樣本,孵育24 h後換成含10%胎牛血清的RMPI.1640 培養液,孵育24 h。

4.觀察並拍照

吸去培養液,用PBS清洗3次後,在倒置螢光顯微鏡下觀察並拍照。

注意事項:[編輯]

  1. 實驗時應注意細胞生長狀況,選擇適當的細胞接種濃度。對不同的細胞要觀察細胞的貼壁率等,確定實驗時細胞的接種數量和培養時間,保證培養終止時密度適當。
  2. 在用PBS緩衝液沖洗時,注意貼壁慢慢加入,以免衝散單層貼壁細胞,影響實驗拍照結果。
  3. 在藥物的篩選過程中,其對細胞遷移能力的影響也是重要的一方面。實驗設計過程中需要選擇適當的陽性對照組和陰性對照組。