细胞生物学/细胞增殖检测MTT法

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细胞增殖检测:MTT法[编辑]

MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide, MTT噻唑蓝为基础。MTT为黄色化合物,是一种接受氢离子的染料,可作用于活细胞线粒体中的呼吸链,在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂,生成蓝色的formazan结晶,formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比(死细胞中琥珀酸脱氢酶消失,不能将MTT还原)。还原生成的formazan结晶可在含50%的N,N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠(pH 4.7)的MTT溶解液中溶解,利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值,以反映出活细胞数目。也可以用DMSO来溶解。

MTT粉末和溶液保存时都需要避光,用铝箔纸包好就可以。实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光,觉得这样比较好。

步骤[编辑]

接种细胞[编辑]

用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液,以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板,每孔体积200ul。

培养细胞[编辑]

同一般培养条件,培养3-5天(可根据试验目的和要求决定培养时间)。

呈色[编辑]

培养3-5天后,每孔加MTT溶液(5mg/ml用PBS 配)20ul.继续孵育4小时,终止培养,小心吸弃孔内培养上清液,对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO,振荡10分钟,使结晶物充分融解。

比色[编辑]

选择490nm波长,在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值,记录结果,以时间为横坐标,吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

注意事项[编辑]

1、选择适当得细胞接种浓度。

2、避免血清干扰:一般选小于10%的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。

3、设空白对照:与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致,最后比色以空白调零。

MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间,超出这个范围就不是直线关系,

IC50是半抑制率,意思是抑制率50%的时候药物的浓度。把药品稀释成不同的浓度,然后计算各自的抑制率,以药品的浓度为横坐标,抑制率为纵坐标作图,然后得到50%抑制率时候的药品浓度,就是IC50。要点:药品2倍稀释,多做梯度,做点线图即可!

举例[编辑]

各组浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001,稀释倍数为10,最大浓度为0.1,抑制率为0.95、0.80、0.65、0.43、0.21,0.06。代入计算公式:

Pm=0.95

Pn=0.06

P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1

Xm=lg0.1=-1

lgI=lg0.1/0.01=1

lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025

IC50=0.00025

有一个公式可供参考;

lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)

Xm:lg 最大剂量

I:lg(最大剂量/相临剂量)

P:阳性反应率之和

Pm:最大阳性反应率

Pn:最小阳性反应率

抑制率=1-加药组OD值/对照组OD值

公式中的最大最小阳性反应率就是最大最小抑制率

例:

用96孔板培养SMMC-7721肝癌做MTT测细胞活力,应该加多少1640培养基,多少MTT和DMSO合适?根据书上说的加200ul1640,20ulMTT,150ulDMSO 加DMSO之前要尽量去掉培养液,便于DMSO溶解甲臜颗粒进行比色测定

一般每孔4000个细胞为宜,既细胞浓度在20000个/ml,MTT加20ul,作用四小时后洗掉上清液,注意不要将甲瓉洗掉,然后每孔加150ul DMSO,在脱色摇床上振荡10分钟,然后测吸光值。

一般要低于IC50,避免非调亡性杀伤的细胞太多,造成流式细胞仪检测碎片太多。我一般用1/2-1/3的IC50,作用时间为36h。一般肿瘤细胞系空白处理的调亡率应低于1%,用药后一般为5-10%(Annexin V),细胞周期的亚G0峰比较明显。

MTT法心得[编辑]

MTT实验是检测细胞活力的实验方法,由于细胞活力与细胞数呈正相关,因此也常常用来检测细胞的增殖情况。

MTT的原理[编辑]

活细胞有琥珀酸脱氢酶,将MTT还原成棕褐色沉淀。由于一般介绍园子里已经很多,笔者将自己的心得按照实验流程与大家交流交流。

MTT法检测细胞增殖实验的注意事项[编辑]

培养好细胞点板[编辑]

养细胞没啥好说的,如果不知道细胞如何养,那就看看相关的文献方法。如果知道了细胞的名字,就可以上www.atcc.org检索细胞的培养信息,这个网站上的培养方法是标准培养方法。当然可以根据自己实验要求进行修改。由于细胞计数很繁琐,点板时的细胞浓度是最难掌握的,这一点笔者的心得如下:

自己先将细胞养一段时间,大概了解细胞的增殖情况,在MTT检测时实际上要求细胞大概能长满96-孔板的80-90%,如果打算养48小时就检测,根据细胞的生长情况反推点板时的细胞浓度状况。这时可以将细胞不进行计数,将消化好的细胞混匀后(可能是10ml)直接在一个废弃(最好进行过无菌处理)的96孔板中依次加入180、100、50微升细胞,将细胞放置几分钟就会沉到板底了,这时在显微镜下观察,推测哪个孔的细胞48 h能基本长满板底,假设50微升的孔比较合适,而点板时没孔需点200 微升,那么就将细胞浓度再稀释4倍就可以正式点板了,这时顺便将细胞进行计数(因为实验记录要求写啊)。这样就OK了!如果细胞还太多,将细胞稀释4倍后再重复以上操作。注意:不要过分信赖细胞计数,因为细胞计数的取样量为20 微升左右,由于颗粒的分布不均匀,代表性是很差的。建议:细胞计数一定要会,但不要完全依赖它。

点板时一定要将细胞消化成单个细胞,而且一定要混匀,最好用排枪,否则,MTT的SD会狂大!

点板布局[编辑]

其实这一点很多人不懈一顾。如果你的细胞要养48 h或更长,建议不要吝啬96-孔板的四周边孔,这32个边孔不能使用,建议加入灭菌PBS以饱和中间64个孔的水分。因为细胞培养过程中,边孔的水分蒸发很快,培养液及里面的药物会出现浓缩现象,细胞的状况就复杂了,有些人称之为%26ldquo;边缘效应%26rdquo;这些孔的SD也会狂大,既然如此,不如不用。

加MTT[编辑]

如果确认你考察的药物没有氧化还原性,你可以直接加入MTT溶液(总体积的1/10),如果你没有把握,建议在加MTT前换一次液;如果你肯定考察的药物的氧化还原性很强,比如谷胱甘肽、Vit E、VitC,那建议你用PBS将细胞洗洗,否则这些药物会将MTT还原成棕褐色沉淀,这种效果可能是你不需要的。

加入MTT后的反应[编辑]

时间为3-4h,此时弃去各孔中的液体在加入200微升的DMSO。为了将沉淀溶解完全,尽可能将水弃除干净,加入DMSO后在摇床上震摇10min。提醒:如果你的细胞贴壁不好,此时的沉淀在弃去液体时易丢失,因此贴壁不好的细胞在点板时记得将96孔板用多聚赖氨酸处理处理,要么在弃液体时先用甩板机离心,再轻轻弃去液体。关于DMSO的量,每孔的体积有点儿差异不干扰检测,只要能将沉淀完全溶解就行了。至于DMSO的体积差异不同为什么不影响检测值已经被数学证明了,在此我不多说,如果有人不明白我再证明给他看。当然为了养成良好的实验习惯,DMSO的体积还是一致的好。

检测MTT[编辑]

还原的MTT在460-630均有较好的吸收,如果你的酶标仪是滤光片,可以选470 nm左右或630 nm左右的滤光片,如果酶标仪有单波长,你可以在检测前扫描一下吸收谱,选用最大细说波长检测就是了,最大波长,大概在550nm附近,必要时加一个参比波长以扣除非特异性吸收。

吸收值分析[编辑]

在理想的MTT实验中,如果是细胞抑制实验,不加药物处理组的吸收值应该在0.8-1.2左右,太小检测误差占的比例较多,太大吸收值可能已经超出线性范围。这个原理在朗伯-比尔定律中有解释。

建议[编辑]

如果你觉得MTT中出现的问题不好解决,那么建议你做CCK-8实验,原理与MTT相似,但操作上简化些,当然,费用也稍微高一些。