生物化学与分子生物学/原核生物的转录过程

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RNA的合成 - 原核生物转录的模板和酶 - 原核生物的转录过程 - 真核生物RNA的合成 - 真核生物前体RNA的加工和降解
原核生物的转录过程可分为转录起始、转录延长和转录终止三个阶段。

转录起始需要RNA聚合酶全酶[编辑]

转录全过程均需RNA pol催化,起始过程需全酶,由σ亚基辨认起始点,延长过程的核苷酸聚合仅需核心酶催化。简言之,转录起始就是RNA pol在DNA模板的转录起始区装配形成转录起始复合体,打开DNA双链,并完成第一和第二个核苷酸间聚合反应的过程。转录起始复合物中包含有RNA pol全酶、DNA模板以及与转录起点配对的NTPs。
起始阶段的第一步是由RNA pol识别并结合启动子,形成闭合转录复合体(closed transcription omplex), 其中的DNA仍保持完整的双链结构。原核生物需要靠RNA pol中的σ亚基辨认转录起始区和转录起点。首先被辨认的DNA区段是-35区的TTGACA序列,在这一区段,酶与模板的结合松弛;接着酶移向-10区的TATAAT序列并跨过了转录起点,形成与模板的稳定结合。
起始的第二步是DNA双链打开,闭合转录复合体成为开放转录复合体(open transcription complex)。开放转录复合体中DNA分子接近-10区域的部分双螺旋解开后转录开始。无论是转录起始或延长中,DNA双链解开的范围都只在17bp左右,这比复制中形成的复制叉小得多。
起始的第三步是第一个磷酸二酯键的形成。转录起始不需引物,两个与模板配对的相邻核苷酸,在RNA pol催化下生成磷酸二酯键。转录起点配对生成的RNA的第一位核苷酸,也是新合成的RNA分子的5'-端,以GTP或ATP较为常见。比如,当5'-端第一位核苷酸GTP与第二位的NTP聚合生成磷酸二酯键后,仍保留其5'-端3个磷酸基团,生成聚合物是5'-pppGpN-OH-3', 其3'-端的游离羟基,可以接收新的NTP并与之聚合,使RNA链延长下去。RNA链的5'-端结构在转录延长中一直保留,至转录完成。
RNA合成开始时会发生流产式起始(abortiveinitiation)的现象。发生流产式起始的时候,RNA pol在完全进入延伸阶段前不从启动子上脱离,而是合成长度小于10个核苷酸的RNA分子,并将这些短片段RNA从聚合酶上释放而终止转录。这个过程可在进入转录延长阶段前重复多次,从而产生多个短片段RNA。流产式起始被认为是启动子校对(promoter proofreading)的过程,其发生可能与RNA聚合酶和启动子的结合强度有关。
当一个聚合酶成功合成一条超过10个核苷酸的RNA时,便形成一个稳定的包含有DNA模板、RNA pol和RNA片段的三重复合体,从而进入延长阶段。当RNA合成起始成功后,RNA pol离开启动子,称为启动子解脱(promoter escape), 也叫启动子清除(promoter clearance)。启动子清除发生后,转录进入延长阶段。

RNA聚合酶核心酶独立延长RNA链[编辑]

第一个磷酸二酯键生成后,转录复合体的构象发生改变,σ亚基从转录起始复合物上脱落,并离开启动子,RNA合成进入延长阶段。此时,仅有RNA pol的核心酶留在DNA模板上,并沿DNA链不断前移,催化RNA链的延长。实验证明,σ亚基若不脱落,RNA pol则停留在起始位置,转录不继续进行。化学计量又证明,每个原核细胞,RNA pol各亚基比例为:α:β:β':σ=4000:2000:2000:600, α因子的量在细胞内明显比核心酶少。在体外进行的RNA合成实验也证明,RNA的生成量与核心酶的加入量成正比;开始转录后,产物量与σ亚基加入与否无关。脱落后的σ因子又可再形成另一全酶,反复使用。
RNA链延长时,核心酶会沿着模板DNA不断向下游前移。聚合反应局部前方的DNA双链不断解链,合成完成后的部分又重新恢复双螺旋结构。核心酶可以覆盖40bp以上的DNA分子段落,但转录解链范围约17bp。RNA链延长过程中的解链和再聚合可视为这一17bp左右的开链区在DNA上的动态移动,其外观类似泡状,被称为“转录泡” (transcription bubble)。
在解链区局部, RNA pol的核心酶催化着模板指导的RNA链延长,转录产物3'-端会有一小段暂时与模板DNA保持结合状态,形成一8bp的RNA-DNA杂合双链(hybrid duplex)。随着RNA链不断生长,5'-端脱离模板向空泡外伸展。从化学结构看,DNA/DNA双链结构比DNA/RNA形成的杂化双链稳定。核酸的碱基之间有3种配对方式,其稳定性是:G=C>A=T>A=U。GC配对有3个氢键,是最稳定的;AT配对只在DNA双链形成;AU配对可在RNA分子或DNA/RNA杂化双链上形成,是3种配对中稳定性最低的。所以已转录完毕的局部DNA双链,就必然会复合而不再打开。根据这些道理,也就易于理解空泡为什么会形成,而转录产物又是为什么可以向外伸出了。

原核生物转录延长与蛋白质的翻译同时进行[编辑]

在电子显微镜下观察原核生物的转录产物,可看到像羽毛状的图形。进一步分析表明,在同一个DNA模板分子上,有多个转录复合体同时在进行着RNA的合成;在新合成的mRNA链上还可观察到结合在上面的多个核糖体,即多聚核糖体。这是因为在原核生物,RNA链的转录合成尚未完成,蛋白质的合成已经将其作为模板开始进行翻译了。转录和翻译的同步进行在原核生物是较为普遍的现象,保证了转录和翻译都以高效率运行,满足它们快速增殖的需要。

原核生物转录终止分为依赖ρ因子与非依赖ρ因子两大类[编辑]

RNA pol在DNA模板上停顿下来不再前进,转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来,就是转录终止。依据是否需要蛋白质因子的参与,原核生物的转录终止分为依赖ρ(Rho)因子与非依赖ρ因子两大类。

依赖ρ因子的转录终止[编辑]

用T4噬菌体DNA作体外转录实验,发现其转录产物比在细胞内转录出的产物要长。这一方面说明转录终止点是可以被跨越而继续转录的;还说明细胞内的某些因子有执行转录终止的功能。根据这些线索,1969年,Roberts J在T4噬菌体感染的大肠杆菌中发现了能控制转录终止的蛋白质,命名为ρ因子。体外转录体系中加入了ρ因子后,转录产物长于细胞内的现象不复存在。ρ因子是由相同亚基组成的六聚体蛋白质,亚基分子量为46kD。ρ因子能结合RNA, 又以对poly C的结合力最强,但对poly dC/dG组成的DNA的结合能力就低得多。
在依赖ρ因子终止的转录中,产物RNA的3'-端会依照DNA模板,产生较丰富而且有规律的C碱基。ρ因子正是识别产物RNA上这些终止信号序列,并与之结合。结合RNA后的ρ因子和RNA pol都可发生构象变化,从而使RNA pol的移动停顿,ρ因子中的解旋酶活性使DNA/RNA杂化双链拆离,RNA产物从转录复合物中释放,转录终止。

非依赖ρ因子的转录终止[编辑]

DNA模板上靠近转录终止处有些特殊碱基序列,转录出RNA后,RNA产物可以形成特殊的结构来终止转录,不需要蛋白因子的协助,即非依赖ρ因子的转录终止。可导致终止的转录产物的3'-端常有多个连续的U,其上游的一段特殊碱基序列又可形成鼓槌状的茎环或发夹形式的二级结构,这些结构的形成是非依赖ρ因子终止的信号。
RNA链延长至接近终止区时,转录出的RNA片段随即形成茎-环结构。这种二级结构是阻止转录继续向下游推进的关键。其机制可从两方而理解:一是RNA分子形成的茎环结构可能改变RNA pol的构象。注意RNA pol的分子量大,它不但覆盖转录延长区,也覆盖部分3'-端新合成的RNA链,包括刚形成的RNA茎环结构。RNA茎环结构可影响RNA pol的结构而使其构象改变,从而使RNA pol-DNA模板的结合方式发生改变。RNA pol不再向下游移动,于是转录停止。其二,转录复合物 (RNA pol-DNA-RNA)上形成的局部RNA/DNA杂化短链的碱基配对是不稳定的,随着RNA茎环结构的形成,RNA从DNA模板链上脱离,单链DNA复原为双链,转录泡关闭,转录终止。另外,RNA链上的多聚U也是促使RNA链从模板上脱落的重要因素。