生物化學與分子生物學/原核生物的轉錄過程

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RNA的合成 - 原核生物轉錄的模板和酶 - 原核生物的轉錄過程 - 真核生物RNA的合成 - 真核生物前體RNA的加工和降解
原核生物的轉錄過程可分為轉錄起始、轉錄延長和轉錄終止三個階段。

轉錄起始需要RNA聚合酶全酶[編輯]

轉錄全過程均需RNA pol催化,起始過程需全酶,由σ亞基辨認起始點,延長過程的核苷酸聚合僅需核心酶催化。簡言之,轉錄起始就是RNA pol在DNA模板的轉錄起始區裝配形成轉錄起始複合體,打開DNA雙鏈,並完成第一和第二個核苷酸間聚合反應的過程。轉錄起始複合物中包含有RNA pol全酶、DNA模板以及與轉錄起點配對的NTPs。
起始階段的第一步是由RNA pol識別並結合啟動子,形成閉合轉錄複合體(closed transcription omplex), 其中的DNA仍保持完整的雙鏈結構。原核生物需要靠RNA pol中的σ亞基辨認轉錄起始區和轉錄起點。首先被辨認的DNA區段是-35區的TTGACA序列,在這一區段,酶與模板的結合鬆弛;接着酶移向-10區的TATAAT序列並跨過了轉錄起點,形成與模板的穩定結合。
起始的第二步是DNA雙鏈打開,閉合轉錄複合體成為開放轉錄複合體(open transcription complex)。開放轉錄複合體中DNA分子接近-10區域的部分雙螺旋解開後轉錄開始。無論是轉錄起始或延長中,DNA雙鏈解開的範圍都只在17bp左右,這比複製中形成的複製叉小得多。
起始的第三步是第一個磷酸二酯鍵的形成。轉錄起始不需引物,兩個與模板配對的相鄰核苷酸,在RNA pol催化下生成磷酸二酯鍵。轉錄起點配對生成的RNA的第一位核苷酸,也是新合成的RNA分子的5'-端,以GTP或ATP較為常見。比如,當5'-端第一位核苷酸GTP與第二位的NTP聚合生成磷酸二酯鍵後,仍保留其5'-端3個磷酸基團,生成聚合物是5'-pppGpN-OH-3', 其3'-端的游離羥基,可以接收新的NTP並與之聚合,使RNA鏈延長下去。RNA鏈的5'-端結構在轉錄延長中一直保留,至轉錄完成。
RNA合成開始時會發生流產式起始(abortiveinitiation)的現象。發生流產式起始的時候,RNA pol在完全進入延伸階段前不從啟動子上脫離,而是合成長度小於10個核苷酸的RNA分子,並將這些短片段RNA從聚合酶上釋放而終止轉錄。這個過程可在進入轉錄延長階段前重複多次,從而產生多個短片段RNA。流產式起始被認為是啟動子校對(promoter proofreading)的過程,其發生可能與RNA聚合酶和啟動子的結合強度有關。
當一個聚合酶成功合成一條超過10個核苷酸的RNA時,便形成一個穩定的包含有DNA模板、RNA pol和RNA片段的三重複合體,從而進入延長階段。當RNA合成起始成功後,RNA pol離開啟動子,稱為啟動子解脫(promoter escape), 也叫啟動子清除(promoter clearance)。啟動子清除發生後,轉錄進入延長階段。

RNA聚合酶核心酶獨立延長RNA鏈[編輯]

第一個磷酸二酯鍵生成後,轉錄複合體的構象發生改變,σ亞基從轉錄起始複合物上脫落,並離開啟動子,RNA合成進入延長階段。此時,僅有RNA pol的核心酶留在DNA模板上,並沿DNA鏈不斷前移,催化RNA鏈的延長。實驗證明,σ亞基若不脫落,RNA pol則停留在起始位置,轉錄不繼續進行。化學計量又證明,每個原核細胞,RNA pol各亞基比例為:α:β:β':σ=4000:2000:2000:600, α因子的量在細胞內明顯比核心酶少。在體外進行的RNA合成實驗也證明,RNA的生成量與核心酶的加入量成正比;開始轉錄後,產物量與σ亞基加入與否無關。脫落後的σ因子又可再形成另一全酶,反覆使用。
RNA鏈延長時,核心酶會沿着模板DNA不斷向下游前移。聚合反應局部前方的DNA雙鏈不斷解鏈,合成完成後的部分又重新恢復雙螺旋結構。核心酶可以覆蓋40bp以上的DNA分子段落,但轉錄解鏈範圍約17bp。RNA鏈延長過程中的解鏈和再聚合可視為這一17bp左右的開鏈區在DNA上的動態移動,其外觀類似泡狀,被稱為「轉錄泡」 (transcription bubble)。
在解鏈區局部, RNA pol的核心酶催化着模板指導的RNA鏈延長,轉錄產物3'-端會有一小段暫時與模板DNA保持結合狀態,形成一8bp的RNA-DNA雜合雙鏈(hybrid duplex)。隨着RNA鏈不斷生長,5'-端脫離模板向空泡外伸展。從化學結構看,DNA/DNA雙鏈結構比DNA/RNA形成的雜化雙鏈穩定。核酸的鹼基之間有3種配對方式,其穩定性是:G=C>A=T>A=U。GC配對有3個氫鍵,是最穩定的;AT配對只在DNA雙鏈形成;AU配對可在RNA分子或DNA/RNA雜化雙鏈上形成,是3種配對中穩定性最低的。所以已轉錄完畢的局部DNA雙鏈,就必然會複合而不再打開。根據這些道理,也就易於理解空泡為什麼會形成,而轉錄產物又是為什麼可以向外伸出了。

原核生物轉錄延長與蛋白質的翻譯同時進行[編輯]

在電子顯微鏡下觀察原核生物的轉錄產物,可看到像羽毛狀的圖形。進一步分析表明,在同一個DNA模板分子上,有多個轉錄複合體同時在進行着RNA的合成;在新合成的mRNA鏈上還可觀察到結合在上面的多個核糖體,即多聚核糖體。這是因為在原核生物,RNA鏈的轉錄合成尚未完成,蛋白質的合成已經將其作為模板開始進行翻譯了。轉錄和翻譯的同步進行在原核生物是較為普遍的現象,保證了轉錄和翻譯都以高效率運行,滿足它們快速增殖的需要。

原核生物轉錄終止分為依賴ρ因子與非依賴ρ因子兩大類[編輯]

RNA pol在DNA模板上停頓下來不再前進,轉錄產物RNA鏈從轉錄複合物上脫落下來,就是轉錄終止。依據是否需要蛋白質因子的參與,原核生物的轉錄終止分為依賴ρ(Rho)因子與非依賴ρ因子兩大類。

依賴ρ因子的轉錄終止[編輯]

用T4噬菌體DNA作體外轉錄實驗,發現其轉錄產物比在細胞內轉錄出的產物要長。這一方面說明轉錄終止點是可以被跨越而繼續轉錄的;還說明細胞內的某些因子有執行轉錄終止的功能。根據這些線索,1969年,Roberts J在T4噬菌體感染的大腸桿菌中發現了能控制轉錄終止的蛋白質,命名為ρ因子。體外轉錄體系中加入了ρ因子後,轉錄產物長於細胞內的現象不復存在。ρ因子是由相同亞基組成的六聚體蛋白質,亞基分子量為46kD。ρ因子能結合RNA, 又以對poly C的結合力最強,但對poly dC/dG組成的DNA的結合能力就低得多。
在依賴ρ因子終止的轉錄中,產物RNA的3'-端會依照DNA模板,產生較豐富而且有規律的C鹼基。ρ因子正是識別產物RNA上這些終止信號序列,並與之結合。結合RNA後的ρ因子和RNA pol都可發生構象變化,從而使RNA pol的移動停頓,ρ因子中的解旋酶活性使DNA/RNA雜化雙鏈拆離,RNA產物從轉錄複合物中釋放,轉錄終止。

非依賴ρ因子的轉錄終止[編輯]

DNA模板上靠近轉錄終止處有些特殊鹼基序列,轉錄出RNA後,RNA產物可以形成特殊的結構來終止轉錄,不需要蛋白因子的協助,即非依賴ρ因子的轉錄終止。可導致終止的轉錄產物的3'-端常有多個連續的U,其上游的一段特殊鹼基序列又可形成鼓槌狀的莖環或髮夾形式的二級結構,這些結構的形成是非依賴ρ因子終止的信號。
RNA鏈延長至接近終止區時,轉錄出的RNA片段隨即形成莖-環結構。這種二級結構是阻止轉錄繼續向下游推進的關鍵。其機制可從兩方而理解:一是RNA分子形成的莖環結構可能改變RNA pol的構象。注意RNA pol的分子量大,它不但覆蓋轉錄延長區,也覆蓋部分3'-端新合成的RNA鏈,包括剛形成的RNA莖環結構。RNA莖環結構可影響RNA pol的結構而使其構象改變,從而使RNA pol-DNA模板的結合方式發生改變。RNA pol不再向下游移動,於是轉錄停止。其二,轉錄複合物 (RNA pol-DNA-RNA)上形成的局部RNA/DNA雜化短鏈的鹼基配對是不穩定的,隨着RNA莖環結構的形成,RNA從DNA模板鏈上脫離,單鏈DNA復原為雙鏈,轉錄泡關閉,轉錄終止。另外,RNA鏈上的多聚U也是促使RNA鏈從模板上脫落的重要因素。