生物化学与分子生物学/肽链的合成过程

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蛋白质的合成 - 蛋白质合成体系 - 氨基酸与tRNA的连接 - 肽链的合成过程 - 蛋白质合成后的加工和靶向输送 - 蛋白质合成的干扰和抑制
翻译过程包括起始(initiation)、延长(elongation)和终止(termination)三个阶段。真核生物的肽链合成过程与原核生物的肽链合成过程基本相似,只是反应更复杂、涉及的蛋白质因子更多。

翻译起始复合物的装配启动肽链合成[编辑]

翻译的起始是指mRNA、起始氨酰-tRNA分别与核糖体结合而形成翻译起始复合物(translation initiation complex)的过程。

原核生物翻译起始复合物的形成[编辑]

原核生物翻译起始复合物的形成需要30S小亚基 、mRNA、fMet-tRNAfMet和50S大亚基,还需要3种IF、 GTP和Mg2+。其主要步骤如下:

  1. 核糖体大小亚基分离 完整核糖体在IF的帮助下,大、小亚基解离,为结合mRNA和fMet-tRNAfMet做好准备。IF的作用是稳定大、小亚基的分离状态,如没有IF存在,大、小亚基极易重新聚合。
  2. mRNA与核糖体小亚基结合 小亚基与mRNA结合时,可准确识别可读框的起始密码子AUG, 而不会结合内部的AUG,从而正确地翻译出所编码蛋白质。保证这一结合准确性的机制是:mRNA起始密码子AUG上游存在一段被称为核糖体结合位点(ribosome-binding site, RBS)的序列。该序列距AUG上游约10个核苷酸处通常为-AGGAGG-(也称 Shine-Dalgarno 序列,S-D序列),可被16S rRNA通过碱基互补而精确识别,从而将核糖体小亚基准确定位于mRNA。
  3. fMet-tRNAfMet结合在核糖体P位 fMet-tRNAfMet与结合了GTP的IF2一起,识别并结合对应于小亚基P位的mRNA的AUG处。此时,A位被IFl占据,不与任何氨酰-tRNA结合。
  4. 翻译起始复合物形成 结合于IF2的GTP被水解,释放的能量促使3种IF释放,大亚基与结合了mRNA、fMet-tRNAfMet的小亚基结合,形成由完整核糖体、mRNA、fMet-tRNAfMet组成的翻译起始复合物。

如前所述,核糖体上存在着A位、P位和E位这三个重要的功能部位。在肽链合成过程中,新的氨酰-tRNA首先进入A位,形成肽键后移至P位。但是在翻译起始复合物装配时,结合起始密码子的fMet-tRNAfMet是直接结合于核糖体的P位,A位空留,且对应于AUG后的密码子,为下一个氨酰-tRNA的进入及肽链延长做好准备。

真核生物翻译起始复合物的形成[编辑]

真核生物翻译起始复合物的装配所需起始因子的种类更多,其装配过程更复杂,且mRNA的5'-帽和 3'-多聚(A)尾均为正确起始所必需。此外,起始氨酰-tRNA先于mRNA结合于小亚基,与原核生物的装配顺序不同。其主要步骤如下:

  1. 43S前起始复合物的形成 多种起始因子与核糖体小亚基结合,其中 eIFlA和 eIF3与原核起始因子IFl 和IF3功能相似,可阻止tRNA结合A位,并防止大亚基和小亚基过早结合。eIFl结合于E位,GTP-eIF2与起始氨酰-tRNA结合,随后 eIF5和 eIF5B加入,形成43S的前起始复合物。
  2. mRNA与核糖体小亚基结合 mRNA 与 43S 前起始复合物的结合由 eIF4F 复合物介导。eIF4F 由 eIF4E(结合 mRNA 5'-帽)、eIF4A(具 ATPase 及 RNA 解旋酶活性)和 eIF4G 组成(结合 eIF3、eIF4E和 PABP)。
  3. 核糖体大亚基的结合 mRNA 与 43S 前起始复合物及 elF4F 复合物结合后产生 48S 起始复合物,此复合物从 mRNA5'-端向 3'-端扫描起始并定位起始密码子,随后大亚基加入,起始因子释放,翻译起始复合物形成。此过程需要 eIF5 和 eIF5B 参与,eIF5 促使 eIF2 发挥 GTPase 活性,水解与之结合的 GTP 生成 eIF2-GDP,使得 eIF2-GDP 与起始 tRNA 的亲和力减弱。eIF5B 是原核 IF2 的同源物,通过水解与之结合的 GTP, 促进 eIF2-GDP 与其他起始因子解离。

值得一提的是,有些 mRNA 的翻译起始并不依赖其 5'-帽结构,在翻译起始时,核糖体可被 mRNA上的内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site, IRES) 直接招募至翻译起始处,这一过程需要多种蛋白质如 IRES 反式作用因子(IRES trans-acting factors, ITAFs)、eIF4GI 等的协助。

在核糖体上重复进行的三步反应延长肽链[编辑]

翻译起始复合物形成后,核糖体从mRNA 的 5'-端向 3'-端移动,依据密码子顺序,从 N-端开始向C端合成多肽链。 这是一个在核糖体上重复进行的进位、成肽和转位的循环过程,每循环1次,肽链上即可增加 1 个氨基酸残基。这一过程除了需要 mRNA 、tRNA 和核糖体外,还需要数种延长因子以及 GTP 等参与。原核生物与真核生物的肽链延长过程基本相似,只是反应体系和延长因子不同。这里主要介绍原核生物的肽链延长过程。
1、进位 指氨酰-tRNA按照mRNA模板的指令进入核糖体A位的过程,又称注册。翻译起始复合物中的 A 位是空闲的,并对应着可读框的第二个密码子,进入 A 位的氨酰-tRNA 种类即由该密码子决定。氨酰tRNA 先与 GTP-EF-Tu 结合成一复合物,然后进入 A 位,GTP 随之水解,EF-Tu-GDP 从核糖体释放。GTP-EF-Tu 又可循环生成。
核糖体对氨酰-tRNA 的进位有校正作用。肽链生物合成以很高速度进行,延长阶段的每一过程都有时限。在此时限内,只有正确的氨酰-tRNA能迅速发生反密码子-密码子互补配对而进入 A 位。反之,错误的氨酰-tRNA 因反密码子-密码子不能配对结合而从 A 位解离。 这是维待肽链生物合成的高度保真性的机制之一。
2、成肽 指核糖体A 位和 P 位上的 tRNA所携带的氨基酸缩合成肽的过程。在起始复合物中,P位上起始 tRNA所携带的甲酰甲硫氨酸与 A 位上新进位的氨酰 tRNA 的 α-氨基缩合形成二肽。 第一个肽键形成后,二肽酰-tRNA 占据核糖体 A 位,而卸载了氨基酸的 tRNA 仍在 P 位。成肽(peptide bond formation) 过程由肽酰转移酶(peptidyl transferase) 催化,该酶的化学本质不是蛋白质,而是 RNA,在原核生物为 23S rRNA, 在真核生物为 28S rRNA。因此肽酰转移酶属于一种核酶(ribozyme)。
3、转位 成肽反应后,核糖体需要向 mRNA的 3'-端移动一个密码子的距离,方可阅读下一个密码子,此过程为转位(translocation)。核糖体的转位需要延长因子 EF-G(即转位酶),并需要 GTP 水解供能。转位的结果是:①P位上的 tRNA所携带的氨基酸或肽在成肽后交给 A 位上的氨基酸,P 位上卸载的 tRNA 转位后进入 E 位,然后从核糖体脱落;②成肽后位于A位的肽酰-tRNA 移动到 P 位;③A位得以空出,且准确定位在mRNA的下一个密码子,以接受下一个氨酰-tRNA进位。
经过第二轮进位—成肽一转位,P 位出现三肽酰-tRNA,A 位空留并对应于第四个氨酰-tRNA 进位。重复此过程,则有四肽酰-tRNA、五肽酰-tRNA 等陆续出现于核糖体 P 位,A 位空留,接受下一个氨酰-tRNA 进位。这样,核糖体从 mRNA 的 5'-端向 3'-端顺序阅读密码子,进位、成肽和转位三步反应循环进行,每循环一次向肽链C端添加一个氨基酸残基,肽链由N-端向C-端逐渐延长。
真核生物的肽链延长机制与原核生物基本相同,但亦有差异,如两者所需延长因子不同,真核生物需要 eEFlα、eEF1βγ和 eEF2 这三类延长因子,其功能分别对应于原核生物的 EF-Tu、EF-Ts 和 EF-G。此外,在真核生物,一个新的氨酰-tRNA 进入 A 位后会产生别构效应,致使空载 tRNA 从 E 位排出。
在肽链延长阶段,每生成一个肽键,都需要水解 2 分子 GTP(进位与转位各 1 分子)获取能量,即消耗2个高能磷酸键。若出现不正确氨基酸进入肽链,也需要消耗能量来水解清除;此外,氨基酸活化为氨酰-tRNA 时需消耗2个高能磷酸键。因此,在蛋白质合成过程中,每生成1个肤键,至少需消耗4个高能磷酸键。

终止密码子和释放因子导致肽链合成终止[编辑]

肽链上每增加一个氨基酸残基,就需要经过一次进位、成肽和转位反应。如此往复,直到核糖体 的 A 位与 mRNA 的终止密码子对应。
终止密码子不被任何氨酰-tRNA识别,只有释放因子RF能识别终止密码子而进入A位,这一识别过程需要水解GTP。RF的结合可触发核糖体构象改变,将肽酰转移酶转变为酯酶,水解P位上肽酰tRNA中肽链与tRNA之间的酯键,新生肽链随之释放,mRNA、tRNA及RF从核糖体脱离,核糖体大小亚基分离。mRNA模板、各种蛋白质因子及其他组分都可被重新利用。
原核生物有3种RF。RFl特异识别UAA或UAG,RF2特异识别UAA或UGA,且两者均可诱导肽酰转移酶转变为酯酶。RF3具有GTPase活性,当新生肽链从核糖体释放后,促进RFl或RF2与核糖体分离。真核生物仅有一种释放因子eRF,3种终止密码子均可被其识别。
无论在原核细胞还是真核细胞内,1条mRNA模板链上都可附着10~100个核糖体。这些核糖体依次结合起始密码子并沿mRNA5'→3'方向移动,同时进行同一条肽链的合成。多个核糖体结合在1条mRNA链上所形成的聚合物称为多聚核糖体(polyribosome或polysome)。多聚核糖体的形成可以使肽链合成高速度、高效率进行。
原核生物的转录和翻译过程紧密偶联,转录未完成时已有核糖体结合于mRNA分子的5'-端开始翻译。真核生物的转录发生在细胞核,翻译在细胞质,因此这两个过程分隔进行。