生物化學與分子生物學/肽鏈的合成過程

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蛋白質的合成 - 蛋白質合成體系 - 胺基酸與tRNA的連接 - 肽鏈的合成過程 - 蛋白質合成後的加工和靶向輸送 - 蛋白質合成的干擾和抑制
翻譯過程包括起始(initiation)、延長(elongation)和終止(termination)三個階段。真核生物的肽鏈合成過程與原核生物的肽鏈合成過程基本相似,只是反應更複雜、涉及的蛋白質因子更多。

翻譯起始複合物的裝配啟動肽鏈合成[編輯]

翻譯的起始是指mRNA、起始氨醯-tRNA分別與核糖體結合而形成翻譯起始複合物(translation initiation complex)的過程。

原核生物翻譯起始複合物的形成[編輯]

原核生物翻譯起始複合物的形成需要30S小亞基 、mRNA、fMet-tRNAfMet和50S大亞基,還需要3種IF、 GTP和Mg2+。其主要步驟如下:

  1. 核糖體大小亞基分離 完整核糖體在IF的幫助下,大、小亞基解離,為結合mRNA和fMet-tRNAfMet做好準備。IF的作用是穩定大、小亞基的分離狀態,如沒有IF存在,大、小亞基極易重新聚合。
  2. mRNA與核糖體小亞基結合 小亞基與mRNA結合時,可準確識別可讀框的起始密碼子AUG, 而不會結合內部的AUG,從而正確地翻譯出所編碼蛋白質。保證這一結合準確性的機制是:mRNA起始密碼子AUG上游存在一段被稱為核糖體結合位點(ribosome-binding site, RBS)的序列。該序列距AUG上游約10個核苷酸處通常為-AGGAGG-(也稱 Shine-Dalgarno 序列,S-D序列),可被16S rRNA通過鹼基互補而精確識別,從而將核糖體小亞基準確定位於mRNA。
  3. fMet-tRNAfMet結合在核糖體P位 fMet-tRNAfMet與結合了GTP的IF2一起,識別並結合對應於小亞基P位的mRNA的AUG處。此時,A位被IFl佔據,不與任何氨醯-tRNA結合。
  4. 翻譯起始複合物形成 結合於IF2的GTP被水解,釋放的能量促使3種IF釋放,大亞基與結合了mRNA、fMet-tRNAfMet的小亞基結合,形成由完整核糖體、mRNA、fMet-tRNAfMet組成的翻譯起始複合物。

如前所述,核糖體上存在着A位、P位和E位這三個重要的功能部位。在肽鏈合成過程中,新的氨醯-tRNA首先進入A位,形成肽鍵後移至P位。但是在翻譯起始複合物裝配時,結合起始密碼子的fMet-tRNAfMet是直接結合於核糖體的P位,A位空留,且對應於AUG後的密碼子,為下一個氨醯-tRNA的進入及肽鏈延長做好準備。

真核生物翻譯起始複合物的形成[編輯]

真核生物翻譯起始複合物的裝配所需起始因子的種類更多,其裝配過程更複雜,且mRNA的5'-帽和 3'-多聚(A)尾均為正確起始所必需。此外,起始氨醯-tRNA先於mRNA結合於小亞基,與原核生物的裝配順序不同。其主要步驟如下:

  1. 43S前起始複合物的形成 多種起始因子與核糖體小亞基結合,其中 eIFlA和 eIF3與原核起始因子IFl 和IF3功能相似,可阻止tRNA結合A位,並防止大亞基和小亞基過早結合。eIFl結合於E位,GTP-eIF2與起始氨醯-tRNA結合,隨後 eIF5和 eIF5B加入,形成43S的前起始複合物。
  2. mRNA與核糖體小亞基結合 mRNA 與 43S 前起始複合物的結合由 eIF4F 複合物介導。eIF4F 由 eIF4E(結合 mRNA 5'-帽)、eIF4A(具 ATPase 及 RNA 解旋酶活性)和 eIF4G 組成(結合 eIF3、eIF4E和 PABP)。
  3. 核糖體大亞基的結合 mRNA 與 43S 前起始複合物及 elF4F 複合物結合後產生 48S 起始複合物,此複合物從 mRNA5'-端向 3'-端掃描起始並定位起始密碼子,隨後大亞基加入,起始因子釋放,翻譯起始複合物形成。此過程需要 eIF5 和 eIF5B 參與,eIF5 促使 eIF2 發揮 GTPase 活性,水解與之結合的 GTP 生成 eIF2-GDP,使得 eIF2-GDP 與起始 tRNA 的親和力減弱。eIF5B 是原核 IF2 的同源物,通過水解與之結合的 GTP, 促進 eIF2-GDP 與其他起始因子解離。

值得一提的是,有些 mRNA 的翻譯起始並不依賴其 5'-帽結構,在翻譯起始時,核糖體可被 mRNA上的內部核糖體進入位點(internal ribosome entry site, IRES) 直接招募至翻譯起始處,這一過程需要多種蛋白質如 IRES 反式作用因子(IRES trans-acting factors, ITAFs)、eIF4GI 等的協助。

在核糖體上重複進行的三步反應延長肽鏈[編輯]

翻譯起始複合物形成後,核糖體從mRNA 的 5'-端向 3'-端移動,依據密碼子順序,從 N-端開始向C端合成多肽鏈。 這是一個在核糖體上重複進行的進位、成肽和轉位的循環過程,每循環1次,肽鏈上即可增加 1 個胺基酸殘基。這一過程除了需要 mRNA 、tRNA 和核糖體外,還需要數種延長因子以及 GTP 等參與。原核生物與真核生物的肽鏈延長過程基本相似,只是反應體系和延長因子不同。這裡主要介紹原核生物的肽鏈延長過程。
1、進位 指氨醯-tRNA按照mRNA模板的指令進入核糖體A位的過程,又稱註冊。翻譯起始複合物中的 A 位是空閒的,並對應着可讀框的第二個密碼子,進入 A 位的氨醯-tRNA 種類即由該密碼子決定。氨醯tRNA 先與 GTP-EF-Tu 結合成一複合物,然後進入 A 位,GTP 隨之水解,EF-Tu-GDP 從核糖體釋放。GTP-EF-Tu 又可循環生成。
核糖體對氨醯-tRNA 的進位有校正作用。肽鏈生物合成以很高速度進行,延長階段的每一過程都有時限。在此時限內,只有正確的氨醯-tRNA能迅速發生反密碼子-密碼子互補配對而進入 A 位。反之,錯誤的氨醯-tRNA 因反密碼子-密碼子不能配對結合而從 A 位解離。 這是維待肽鏈生物合成的高度保真性的機制之一。
2、成肽 指核糖體A 位和 P 位上的 tRNA所攜帶的胺基酸縮合成肽的過程。在起始複合物中,P位上起始 tRNA所攜帶的甲醯甲硫氨酸與 A 位上新進位的氨醯 tRNA 的 α-氨基縮合形成二肽。 第一個肽鍵形成後,二肽醯-tRNA 佔據核糖體 A 位,而卸載了胺基酸的 tRNA 仍在 P 位。成肽(peptide bond formation) 過程由肽醯轉移酶(peptidyl transferase) 催化,該酶的化學本質不是蛋白質,而是 RNA,在原核生物為 23S rRNA, 在真核生物為 28S rRNA。因此肽醯轉移酶屬於一種核酶(ribozyme)。
3、轉位 成肽反應後,核糖體需要向 mRNA的 3'-端移動一個密碼子的距離,方可閱讀下一個密碼子,此過程為轉位(translocation)。核糖體的轉位需要延長因子 EF-G(即轉位酶),並需要 GTP 水解供能。轉位的結果是:①P位上的 tRNA所攜帶的胺基酸或肽在成肽後交給 A 位上的胺基酸,P 位上卸載的 tRNA 轉位後進入 E 位,然後從核糖體脫落;②成肽後位於A位的肽醯-tRNA 移動到 P 位;③A位得以空出,且準確定位在mRNA的下一個密碼子,以接受下一個氨醯-tRNA進位。
經過第二輪進位—成肽一轉位,P 位出現三肽醯-tRNA,A 位空留並對應於第四個氨醯-tRNA 進位。重複此過程,則有四肽醯-tRNA、五肽醯-tRNA 等陸續出現於核糖體 P 位,A 位空留,接受下一個氨醯-tRNA 進位。這樣,核糖體從 mRNA 的 5'-端向 3'-端順序閱讀密碼子,進位、成肽和轉位三步反應循環進行,每循環一次向肽鏈C端添加一個胺基酸殘基,肽鏈由N-端向C-端逐漸延長。
真核生物的肽鏈延長機制與原核生物基本相同,但亦有差異,如兩者所需延長因子不同,真核生物需要 eEFlα、eEF1βγ和 eEF2 這三類延長因子,其功能分別對應於原核生物的 EF-Tu、EF-Ts 和 EF-G。此外,在真核生物,一個新的氨醯-tRNA 進入 A 位後會產生別構效應,致使空載 tRNA 從 E 位排出。
在肽鏈延長階段,每生成一個肽鍵,都需要水解 2 分子 GTP(進位與轉位各 1 分子)獲取能量,即消耗2個高能磷酸鍵。若出現不正確胺基酸進入肽鏈,也需要消耗能量來水解清除;此外,胺基酸活化為氨醯-tRNA 時需消耗2個高能磷酸鍵。因此,在蛋白質合成過程中,每生成1個膚鍵,至少需消耗4個高能磷酸鍵。

終止密碼子和釋放因子導致肽鏈合成終止[編輯]

肽鏈上每增加一個胺基酸殘基,就需要經過一次進位、成肽和轉位反應。如此往復,直到核糖體 的 A 位與 mRNA 的終止密碼子對應。
終止密碼子不被任何氨醯-tRNA識別,只有釋放因子RF能識別終止密碼子而進入A位,這一識別過程需要水解GTP。RF的結合可觸發核糖體構象改變,將肽醯轉移酶轉變為酯酶,水解P位上肽醯tRNA中肽鏈與tRNA之間的酯鍵,新生肽鏈隨之釋放,mRNA、tRNA及RF從核糖體脫離,核糖體大小亞基分離。mRNA模板、各種蛋白質因子及其他組分都可被重新利用。
原核生物有3種RF。RFl特異識別UAA或UAG,RF2特異識別UAA或UGA,且兩者均可誘導肽醯轉移酶轉變為酯酶。RF3具有GTPase活性,當新生肽鏈從核糖體釋放後,促進RFl或RF2與核糖體分離。真核生物僅有一種釋放因子eRF,3種終止密碼子均可被其識別。
無論在原核細胞還是真核細胞內,1條mRNA模板鏈上都可附着10~100個核糖體。這些核糖體依次結合起始密碼子並沿mRNA5'→3'方向移動,同時進行同一條肽鏈的合成。多個核糖體結合在1條mRNA鏈上所形成的聚合物稱為多聚核糖體(polyribosome或polysome)。多聚核糖體的形成可以使肽鏈合成高速度、高效率進行。
原核生物的轉錄和翻譯過程緊密偶聯,轉錄未完成時已有核糖體結合於mRNA分子的5'-端開始翻譯。真核生物的轉錄發生在細胞核,翻譯在細胞質,因此這兩個過程分隔進行。