生物化学与分子生物学/DNA复制的酶学和拓扑学

DNA的生物合成 - DNA复制的基本规律 - DNA复制的酶学和拓扑学 - 原核生物DNA复制过程 - 真核生物DNA复制过程 - 逆转录
DNA复制是酶促核苷酸聚合反应，底物是dATP、dGTP、dCTP和 dTIP, 总称dNTP。dNTP底物有3个磷酸基团，最靠近核糖的称为α-P, 向外依次为β-P和γ-P。在聚合反应中，α-P与子链末端核糖的3'-0H连接。
模板是指解开成单链的DNA母链，遵照碱基互补规律，按模板指引合成子链，子链延长有方向性。引物提供3'-0H末端使dNTP可以依次聚合。由于底物的 5'-P 是加合到延长中的子链（或引物）3'-端核糖的3'-OH基上生成磷酸二酯键的，因此新链的延长只可沿5'向3'方向进行。核苷酸和核苷酸之间生成3',5'-磷酸二酯键而逐一聚合，是复制的基本化学反应。

DNA聚合酶催化脱氧核糖核苷酸间的聚合

DNA聚合酶全称是依赖DNA的DNA聚合酶(DNA-dependent DNA polymerase, DNA pol)。DNA pol是1958年由Kornberg A在E. coli中首先发现的。他从细菌沉渣中提取得到纯酶，在试管内加入模板DNA、dNTP和引物，该酶可催化新链DNA生成。这一结果直接证明了DNA是可以复制的，是继DNA双螺旋模型确立后的又一重大发现。 当时将此酶称为复制酶(replicase)。 在发现其他种类的 DNA pol后，Kornberg A发现的DNA聚合酶被称为DNA pol I。

原核生物至少有5种DNA聚合酶

大肠杆菌经人工处理和筛选，可培育出基因变异菌株。DNApol I基因缺陷的菌株，经实验证明照样可进行DNA复制。DNApol I由polA编码，主要在DNA损伤修复中发挥作用，在半保留复制中起到辅助作用。从变异菌株中相继提取到的其他 DNA pol 被分别称为DNA pol Ⅱ和DNA pol Ⅲ。DNA pol Ⅱ由polB编码，当复制过程被损伤的DNA阻碍时重新启动复制叉。这三种聚合酶有5'→3'延长脱氧核苷酸链的聚合活性及3'→5'核酸外切酶活性。DNA pol Ⅳ和DNA pol Ⅴ分别由dinB和umu'₂C编码，属于跨损伤合成DNA聚合酶。
DNA pol Ⅲ由polC 编码，聚合反应比活性远高于pol I, 每分钟可催化多至10⁵次聚合反应，因此 DNA pol Ⅲ是原核生物复制延长中真正起催化作用的酶。DNA pol Ⅲ是由10种(17个）亚基组成的不对称异聚合体, 由2个核心酶(core enzyme)通过1对β亚基构成的滑动夹(sliding clamp)与γ-复合物(γ-complex)、即夹子加载复合体(clamp-loading complex)连接组成。核心酶由α、ε、θ亚基共同组成，主要作用是合成DNA, 有5'→3'聚合活性；ε亚基是复制的保真性所必需；β亚基发挥夹稳DNA模板链，并使酶沿模板滑动的作用；其余的7个亚基统称γ-复合物，包括γ、δ、δ'、φ、χ和两个τ，有促进滑动夹加载、全酶组装至模板上及增强核心酶活性的作用。
DNA pol Ⅰ的二级结构以α-螺旋为主，只能催化延长约20个核苷酸左右，说明它不是复制延长过程中起主要作用的酶。DNA pol Ⅰ在活细胞内的功能主要是对复制中的错误进行校对，对复制和修复中出现的空隙进行填补。
用特异的蛋白酶可以将DNA pol Ⅰ水解为2个片段，小片段共323个氨基酸残基，有5'→3'核酸外切酶活性。大片段共604个氨基酸残基，被称为Klenow片段，具有DNA聚合酶活性和3'→5'核酸外切酶活性。Klenow片段是实验室合成DNA和进行分子生物学研究常用的工具酶。
DNA pol Ⅱ基因发生突变，细菌依然能存活，推想它是在pol Ⅰ和pol Ⅲ缺失情况下暂时起作用的酶。DNA pol Ⅱ对模板的特异性不高，即使在已发生损伤的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因此认为，它参与DNA损伤的应急状态修复。

常见的真核细胞DNA聚合酶有5种

真核细胞的DNA聚合酶至少15种，常见的有5种。
DNA polα合成引物，然后迅速被具有连续合成能力的 DNApolσ和 DNApolε所替换，这一过程称为聚合酶转换(polymerase switching)。DNApolσ负责合成后随链，DNA polε负责合成前导链。至于高等生物中是否还有独立的解旋酶和引物酶，目前还未能确定。但是，在病毒感染培养细胞(HeLa/SV40)的复制体系中，发现SV40病毒的T抗原有解旋酶活性。DNA pol α催化新链延长的长度有限， 但它能催化RNA 链的合成，因此认为它具有引物酶活性。DNA pol β复制的保真度低，可能是参与应急修复复制的酶。DNA pol γ是线粒体 DNA复制的酶。

DNA聚合酶的碱基选择和校读功能

DNA 复制的保真性是遗传信息稳定传代的保证。生物体至少有3种机制实现保真性：

• 遵守严格的碱基配对规律；
• 聚合酶在复制延长中对碱基的选择功能；
• 复制出错时有即时的校对功能。

复制的保真性依赖正确的碱基选择

DNA 复制保真的关键是正确的碱基配对，而碱基配对的关键又在于氢键的形成。G和C 以3个氢键、A 和T 以 2个氢键维持配对，错配碱基之间难以形成氢键。除化学结构限制外，DNA 聚合酶对 配对碱基具有选择作用。
DNA pol是在 DNA 链延长中起催化作用的酶。利用“错配”实验发现，DNA pol Ⅲ对核苷酸的掺入(incorporation)具有选择功能。例如，用 21聚腺苷酸poly(dA)21作模板，用poly(dT)20 作复制引物，观察引物的3'-0H端连上的是否为胸苷酸(T)。尽管反应体系中4种核苷酸都存在，第21位也只会出现T。若仅仅加入单一种类的dNTP作底物，就会“迫使”引物在第21位延长中出现错配。用柱层析技术可以把 DNA pol Ⅲ各个亚基组分分离，然后再重新组合。如果重新组合的 DNA pol Ⅲ不含ε亚基，复制错配频率出现较高，说明ε亚基是执行碱基选择功能的。
DNA 中脱氧核糖以糖苷键与碱基连接，此键有顺式(syn)和反式(anti）两种构象(conformation)。 在B-DNA(右手双螺旋）中，如果碱基是嘌呤，DNA 糖苷键总是反式，与相应的啼唗形成氢键配对。而要形成嘌呤-嘌呤配对，则其中一个嘌呤必须旋转180°, DNA pol Ⅲ对不同构型糖苷键表现不同亲和力，因此实现其选择功能。
前已述及，DNA pol Ⅲ的10个亚基中，以α,ε和θ作为核心酶并组成较大的不对称二聚体。核心酶中，α亚基有5'→3'聚合酶活性，ε有3'→5'核酸外切酶活性以及碱基选择功能。θ亚基未发现有催化活性，可能起维系二聚体的作用。对各亚基功能的深入研究认为，在核苷酸聚合之前或在聚合当时，酶就可以控制碱基的正确选择。

聚合酶中的核酸外切酶活性在复制中辨认切除错配碱基并加以校正

原核生物的 DNA pol Ⅰ、真核生物的 DNA pol σ和 DNA pol ε的3'→5'核酸外切酶活性都很强，可以在复制过程中辨认并切除错配的碱基，对复制错误进行校正，此过程又称错配修复(mismatch repair)。

复制中DNA分子拓扑学变化

DNA分子的碱基埋在双螺旋内部，只有解成单链，才能发挥模板作用。WatsonJ和CrickF在建立DNA双螺旋结构模型时曾指出，生物细胞如何解开DNA双链是理解复制机制的关键。目前已知，多种酶和蛋白质分子共同完成DNA的解链。

多种酶参与DNA解链和稳定单链状态

复制起始时，需多种酶和辅助的蛋白质因子共同解开并理顺DNA双链，且维持DNA分子在一段时间内处于单链状态。
大肠杆菌(Escherichia coli , E.coli)结构简单，繁殖速度快，是较早用于分子遗传学研究的模式生物。对大肠杆菌变异株进行分析，可以阐明各种基因的功能。早期发现的与DNA复制相关的基因曾被命名为dnaA、dnaB、…、dnaX等，分别编码DnaA、DnaB等蛋白质分子。
DnaB作用是利用ATP供能来解开DNA双链，为解旋酶(helicase)。E.coli DNA复制起始的解链是由DnaA、DnaB和DnaC共同起作用而发生的。
DNA分子只要碱基配对，就会有形成双链的倾向。单链结合蛋白(singlestranded binding proten, SSB)具有结合单链DNA的能力，维持模板的单链稳定状态并使其免受细胞内广泛存在的核酸酶的降解。SSB作用时表现协同效应，保证SSB在下游区段的继续结合。可见，它不像聚合酶那样沿着复制方向向前移动，而是不断地结合、脱离。

DNA拓扑异构酶改变DNA超螺旋状态

DNA拓扑异构酶(DNA topoi somerase)简称拓扑酶，广泛存在于原核及真核生物，分为I型和II型两种最近还发现了拓扑酶Ⅲ。原核生物拓扑异构酶II又称促旋酶(gyrase), 真核生物的拓扑酶II还有几种不同亚型。
拓扑一词，在物理学上是指物体或图像作弹性移位而保持物体原有的性质。DNA双螺旋沿轴旋绕，复制解链也沿同一轴反向旋转，复制速度快，旋转达100次／秒，会造成复制叉前方的DNA分子打结、缠绕、连环现象。这种超螺旋及局部松弛等过渡状态，需要拓扑酶作用以改变DNA分子的拓扑构象，理顺DNA链结构来配合复制进程。
拓扑酶既能水解，又能连接DNA分子中磷酸二酯键, 可在将要打结或已打结处切口，下游的DNA穿越切口 并作一定程度旋转，把结打开或解松，然后旋转复位连接。主要有两类拓扑酶在复制中用于松解超螺旋结构。拓扑酶I可以切断DNA双链中一股，使DNA 解链旋转中不致打结，适当时候又把切口封闭，使DNA变为松弛状态，这一反应无需 ATP。拓扑酶II可在一定位置上，切断处于正超螺旋状态的DNA双链，使超螺旋松弛；然后利用ATP供能，松弛状态DNA的断端在同一个酶的催化下连接恢复。这些作用均可使复制中的DNA解开螺旋、连环或 解连环，达到适度盘绕。母链DNA与新合成链也会互相缠绕，形成打结或连环，也需拓扑异构酶II的作用。DNA分子一边解链，一边复制，所以复制全过程都需要拓扑酶。

DNA连接酶连接复制中产生的单链缺口

DNA连接酶(DNA ligase)连接DNA链3'-0H末端和另一DNA链的5'-P末端，两者间生成磷酸二酯键，从而将两段相邻的DNA链连接成完整的链。连接酶的催化作用需要消耗ATP。实验证明：连接酶只能连接双链中的单链缺口，它并没有连接单独存在的DNA单链或RNA单链的作用。复制中的后随链是分段合成的，产生的冈崎片段之间的缺口，要靠连接酶接合。
DNA连接酶不但在复制中起最后接合缺口的作用，在DNA修复、重组中也起接合缺口作用。如果DNA两股都有单链缺口，只要缺口前后的碱基互补，连接酶也可连接。因此它也是基因工程的重要工具酶之一。