生物化學與分子生物學/DNA複製的酶學和拓撲學

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DNA的生物合成 - DNA複製的基本規律 - DNA複製的酶學和拓撲學 - 原核生物DNA複製過程 - 真核生物DNA複製過程 - 逆轉錄
DNA複製是酶促核苷酸聚合反應,底物是dATP、dGTP、dCTP和 dTIP, 總稱dNTP。dNTP底物有3個磷酸基團,最靠近核糖的稱為α-P, 向外依次為β-P和γ-P。在聚合反應中,α-P與子鏈末端核糖的3'-0H連接。
模板是指解開成單鏈的DNA母鏈,遵照鹼基互補規律,按模板指引合成子鏈,子鏈延長有方向性。引物提供3'-0H末端使dNTP可以依次聚合。由於底物的 5'-P 是加合到延長中的子鏈(或引物)3'-端核糖的3'-OH基上生成磷酸二酯鍵的,因此新鏈的延長只可沿5'向3'方向進行。核苷酸和核苷酸之間生成3',5'-磷酸二酯鍵而逐一聚合,是複製的基本化學反應。

DNA聚合酶催化脫氧核糖核苷酸間的聚合[編輯]

DNA聚合酶全稱是依賴DNA的DNA聚合酶(DNA-dependent DNA polymerase, DNA pol)。DNA pol是1958年由Kornberg A在E. coli中首先發現的。他從細菌沉渣中提取得到純酶,在試管內加入模板DNA、dNTP和引物,該酶可催化新鏈DNA生成。這一結果直接證明了DNA是可以複製的,是繼DNA雙螺旋模型確立後的又一重大發現。 當時將此酶稱為複製酶(replicase)。 在發現其他種類的 DNA pol後,Kornberg A發現的DNA聚合酶被稱為DNA pol I。

原核生物至少有5種DNA聚合酶[編輯]

大腸桿菌經人工處理和篩選,可培育出基因變異菌株。DNApol I基因缺陷的菌株,經實驗證明照樣可進行DNA複製。DNApol I由polA編碼,主要在DNA損傷修復中發揮作用,在半保留複製中起到輔助作用。從變異菌株中相繼提取到的其他 DNA pol 被分別稱為DNA pol Ⅱ和DNA pol Ⅲ。DNA pol Ⅱ由polB編碼,當複製過程被損傷的DNA阻礙時重新啟動複製叉。這三種聚合酶有5'→3'延長脫氧核苷酸鏈的聚合活性及3'→5'核酸外切酶活性。DNA pol Ⅳ和DNA pol Ⅴ分別由dinB和umu'2C編碼,屬於跨損傷合成DNA聚合酶。
DNA pol Ⅲ由polC 編碼,聚合反應比活性遠高於pol I, 每分鐘可催化多至105次聚合反應,因此 DNA pol Ⅲ是原核生物複製延長中真正起催化作用的酶。DNA pol Ⅲ是由10種(17個)亞基組成的不對稱異聚合體, 由2個核心酶(core enzyme)通過1對β亞基構成的滑動夾(sliding clamp)與γ-複合物(γ-complex)、即夾子加載複合體(clamp-loading complex)連接組成。核心酶由α、ε、θ亞基共同組成,主要作用是合成DNA, 有5'→3'聚合活性;ε亞基是複製的保真性所必需;β亞基發揮夾穩DNA模板鏈,並使酶沿模板滑動的作用;其餘的7個亞基統稱γ-複合物,包括γ、δ、δ'、φ、χ和兩個τ,有促進滑動夾加載、全酶組裝至模板上及增強核心酶活性的作用。
DNA pol Ⅰ的二級結構以α-螺旋為主,只能催化延長約20個核苷酸左右,說明它不是複製延長過程中起主要作用的酶。DNA pol Ⅰ在活細胞內的功能主要是對複製中的錯誤進行校對,對複製和修復中出現的空隙進行填補。
用特異的蛋白酶可以將DNA pol Ⅰ水解為2個片段,小片段共323個胺基酸殘基,有5'→3'核酸外切酶活性。大片段共604個胺基酸殘基,被稱為Klenow片段,具有DNA聚合酶活性和3'→5'核酸外切酶活性。Klenow片段是實驗室合成DNA和進行分子生物學研究常用的工具酶。
DNA pol Ⅱ基因發生突變,細菌依然能存活,推想它是在pol Ⅰ和pol Ⅲ缺失情況下暫時起作用的酶。DNA pol Ⅱ對模板的特異性不高,即使在已發生損傷的DNA模板上,它也能催化核苷酸聚合。因此認為,它參與DNA損傷的應急狀態修復。

常見的真核細胞DNA聚合酶有5種[編輯]

真核細胞的DNA聚合酶至少15種,常見的有5種。
DNA polα合成引物,然後迅速被具有連續合成能力的 DNApolσ和 DNApolε所替換,這一過程稱為聚合酶轉換(polymerase switching)。DNApolσ負責合成後隨鏈,DNA polε負責合成前導鏈。至於高等生物中是否還有獨立的解旋酶和引物酶,目前還未能確定。但是,在病毒感染培養細胞(HeLa/SV40)的複製體系中,發現SV40病毒的T抗原有解旋酶活性。DNA pol α催化新鏈延長的長度有限, 但它能催化RNA 鏈的合成,因此認為它具有引物酶活性。DNA pol β複製的保真度低,可能是參與應急修復複製的酶。DNA pol γ是線粒體 DNA複製的酶。

DNA聚合酶的鹼基選擇和校讀功能[編輯]

DNA 複製的保真性是遺傳信息穩定傳代的保證。生物體至少有3種機制實現保真性:

  • 遵守嚴格的鹼基配對規律;
  • 聚合酶在複製延長中對鹼基的選擇功能;
  • 複製出錯時有即時的校對功能。

複製的保真性依賴正確的鹼基選擇[編輯]

DNA 複製保真的關鍵是正確的鹼基配對,而鹼基配對的關鍵又在於氫鍵的形成。G和C 以3個氫鍵、A 和T 以 2個氫鍵維持配對,錯配鹼基之間難以形成氫鍵。除化學結構限制外,DNA 聚合酶對 配對鹼基具有選擇作用。
DNA pol是在 DNA 鏈延長中起催化作用的酶。利用「錯配」實驗發現,DNA pol Ⅲ對核苷酸的摻入(incorporation)具有選擇功能。例如,用 21聚腺苷酸poly(dA)21作模板,用poly(dT)20 作複製引物,觀察引物的3'-0H端連上的是否為胸苷酸(T)。儘管反應體系中4種核苷酸都存在,第21位也只會出現T。若僅僅加入單一種類的dNTP作底物,就會「迫使」引物在第21位延長中出現錯配。用柱層析技術可以把 DNA pol Ⅲ各個亞基組分分離,然後再重新組合。如果重新組合的 DNA pol Ⅲ不含ε亞基,複製錯配頻率出現較高,說明ε亞基是執行鹼基選擇功能的。
DNA 中脫氧核糖以糖苷鍵與鹼基連接,此鍵有順式(syn)和反式(anti)兩種構象(conformation)。 在B-DNA(右手雙螺旋)中,如果鹼基是嘌呤,DNA 糖苷鍵總是反式,與相應的啼唗形成氫鍵配對。而要形成嘌呤-嘌呤配對,則其中一個嘌呤必須旋轉180°, DNA pol Ⅲ對不同構型糖苷鍵表現不同親和力,因此實現其選擇功能。
前已述及,DNA pol Ⅲ的10個亞基中,以α,ε和θ作為核心酶並組成較大的不對稱二聚體。核心酶中,α亞基有5'→3'聚合酶活性,ε有3'→5'核酸外切酶活性以及鹼基選擇功能。θ亞基未發現有催化活性,可能起維繫二聚體的作用。對各亞基功能的深入研究認為,在核苷酸聚合之前或在聚合當時,酶就可以控制鹼基的正確選擇。

聚合酶中的核酸外切酶活性在複製中辨認切除錯配鹼基並加以校正[編輯]

原核生物的 DNA pol Ⅰ、真核生物的 DNA pol σ和 DNA pol ε的3'→5'核酸外切酶活性都很強,可以在複製過程中辨認並切除錯配的鹼基,對複製錯誤進行校正,此過程又稱錯配修復(mismatch repair)。

複製中DNA分子拓撲學變化[編輯]

DNA分子的鹼基埋在雙螺旋內部,只有解成單鏈,才能發揮模板作用。WatsonJ和CrickF在建立DNA雙螺旋結構模型時曾指出,生物細胞如何解開DNA雙鏈是理解複製機制的關鍵。目前已知,多種酶和蛋白質分子共同完成DNA的解鏈。

多種酶參與DNA解鏈和穩定單鏈狀態[編輯]

複製起始時,需多種酶和輔助的蛋白質因子共同解開並理順DNA雙鏈,且維持DNA分子在一段時間內處於單鏈狀態。
大腸桿菌(Escherichia coli , E.coli)結構簡單,繁殖速度快,是較早用於分子遺傳學研究的模式生物。對大腸桿菌變異株進行分析,可以闡明各種基因的功能。早期發現的與DNA複製相關的基因曾被命名為dnaA、dnaB、…、dnaX等,分別編碼DnaA、DnaB等蛋白質分子。
DnaB作用是利用ATP供能來解開DNA雙鏈,為解旋酶(helicase)。E.coli DNA複製起始的解鏈是由DnaA、DnaB和DnaC共同起作用而發生的。
DNA分子只要鹼基配對,就會有形成雙鏈的傾向。單鏈結合蛋白(singlestranded binding proten, SSB)具有結合單鏈DNA的能力,維持模板的單鏈穩定狀態並使其免受細胞內廣泛存在的核酸酶的降解。SSB作用時表現協同效應,保證SSB在下游區段的繼續結合。可見,它不像聚合酶那樣沿着複製方向向前移動,而是不斷地結合、脫離。

DNA拓撲異構酶改變DNA超螺旋狀態[編輯]

DNA拓撲異構酶(DNA topoi somerase)簡稱拓撲酶,廣泛存在於原核及真核生物,分為I型和II型兩種最近還發現了拓撲酶Ⅲ。原核生物拓撲異構酶II又稱促旋酶(gyrase), 真核生物的拓撲酶II還有幾種不同亞型。
拓撲一詞,在物理學上是指物體或圖像作彈性移位而保持物體原有的性質。DNA雙螺旋沿軸旋繞,複製解鏈也沿同一軸反向旋轉,複製速度快,旋轉達100次/秒,會造成複製叉前方的DNA分子打結、纏繞、連環現象。這種超螺旋及局部鬆弛等過渡狀態,需要拓撲酶作用以改變DNA分子的拓撲構象,理順DNA鏈結構來配合複製進程。
拓撲酶既能水解,又能連接DNA分子中磷酸二酯鍵, 可在將要打結或已打結處切口,下游的DNA穿越切口 並作一定程度旋轉,把結打開或解松,然後旋轉復位連接。主要有兩類拓撲酶在複製中用於松解超螺旋結構。拓撲酶I可以切斷DNA雙鏈中一股,使DNA 解鏈旋轉中不致打結,適當時候又把切口封閉,使DNA變為鬆弛狀態,這一反應無需 ATP。拓撲酶II可在一定位置上,切斷處於正超螺旋狀態的DNA雙鏈,使超螺旋鬆弛;然後利用ATP供能,鬆弛狀態DNA的斷端在同一個酶的催化下連接恢復。這些作用均可使複製中的DNA解開螺旋、連環或 解連環,達到適度盤繞。母鏈DNA與新合成鏈也會互相纏繞,形成打結或連環,也需拓撲異構酶II的作用。DNA分子一邊解鏈,一邊複製,所以複製全過程都需要拓撲酶。

DNA連接酶連接複製中產生的單鏈缺口[編輯]

DNA連接酶(DNA ligase)連接DNA鏈3'-0H末端和另一DNA鏈的5'-P末端,兩者間生成磷酸二酯鍵,從而將兩段相鄰的DNA鏈連接成完整的鏈。連接酶的催化作用需要消耗ATP。實驗證明:連接酶只能連接雙鏈中的單鏈缺口,它並沒有連接單獨存在的DNA單鏈或RNA單鏈的作用。複製中的後隨鏈是分段合成的,產生的岡崎片段之間的缺口,要靠連接酶接合。
DNA連接酶不但在複製中起最後接合缺口的作用,在DNA修復、重組中也起接合缺口作用。如果DNA兩股都有單鏈缺口,只要缺口前後的鹼基互補,連接酶也可連接。因此它也是基因工程的重要工具酶之一。