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生物化学与分子生物学/DNA实验技术/甲基化检测原理及步骤

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DNA亚硫酸氢盐修饰设计[编辑]

使用CpGenomeTMkit使胞嘧啶转化为尿嘧啶的步骤如下。中等温度碱性pH下使DNA变性成为单链形式暴露出碱基。试剂一,一种包含亚硫酸氢根的钠盐,可使未甲基化的胞嘧啶磺化和水解脱氨,产生一种尿嘧啶磺酸盐中间产物。然后DNA在另一种盐﹙试剂二﹚存在的条件下与一种微粒载体﹙试剂三﹚结合,并通过重复离心和在70%的乙醇中重悬浮脱盐。向尿嘧啶的转化是通过在90%的乙醇中反复碱性脱磺酸基作用和脱盐完成的。DNA最终在TE缓冲液中通过加热从载体上洗脱下来。

第一步:试剂准备[编辑]

  1. 3 M NaOH原料(用前现配):把1g干NaOH片剂溶解在8.3mL水中。使用此类腐蚀性碱,注意小心谨慎和实验操作。
  2. 20 mM NaOH/90% EtOH(用前现配)配制1mL该溶液需:900μl 100%的乙醇,93.4μl水,6.6μl 3M的氢氧化钠。
  3. 溶解试剂Ⅰ(用前现配):打开前将试剂瓶加温至室温。对每份待修饰的样本,称取0.227g DNA修饰试剂Ⅰ加入0.571mL水中。充分涡旋振荡混合。使用该试剂时要小心谨慎,因为它对呼吸系统和皮肤有刺激性。用大约20μl 3M NaOH调整pH至5.0,用pH试纸检测pH值。试剂Ⅰ避光保存以免分解。为了最佳效果,试剂应在配置后立即使用。
  4. 溶解试剂Ⅱ:打开前将试剂瓶加温至室温。将1μl β-巯基乙醇加入20mL去离子水中。每份待修饰的DNA样本需将750μl该溶液加入到1.35g DNA修饰Ⅱ。充分混合确保完全溶解。过量的试剂可用箔纸包裹的容器、2℃-8℃、避光保存长达6周。

第二步:DNA修饰程序[编辑]

  1. 在带有螺旋形瓶盖的1.5-2.0mL的微量离心管中:将7.0μl 3M NaOH加入到含有1.0 μg DNA的100μl水中(10ng/μl),混匀。注意:如果样本含有的DNA量不到1.0μg,就向样本DNA中加入2 μl DNA修饰试剂Ⅳ并加水至总体积100μl。再加入7.0μl 3M NaOH并混匀。
  2. 50℃ DNA孵育10分钟(加热块或水浴)
  3. 加入550 μl新鲜配制的DNA修饰试剂Ⅰ并涡旋振荡。
  4. 加热块或水浴50℃避光孵育4-16小时。

第三步:初步脱盐[编辑]

  1. 强力涡旋振荡悬浮DNA修饰Ⅲ。用10x的1mL塑料移液管枪头来回吸排悬液以分散仍存在的凝块。
  2. 向含DNA溶液的管中加入5μl充分悬浮的DNA修饰试剂Ⅲ。
  3. 加入750μl DNA修饰试剂Ⅱ并充分混匀。
  4. 室温孵育5-10分钟。
  5. 5000 X g离心10秒使DNA试剂Ⅲ成颗粒状。(应出现一种白色的小颗粒。)弃去上清。
  6. 加入1.0mL 70%的乙醇,涡旋振荡,5000 X g离心10秒,弃去上清。该步骤重复进行,共3次。
  7. 将第三次上清弃去后,离心管高速离心2分钟,用塑料移液管枪头移去剩余上清。

第四步:完成DNA修饰(脱磺酸基作用),再次脱盐,并洗脱。[编辑]

  1. 适量样本加入50μl 20 mM NaOH/90% EtOH溶液。
  2. 充分涡旋振荡悬浮颗粒,再室温孵育5分钟。
  3. 5000 X g离心以移除管顶所有成分。加入1.0mL 90%的乙醇并涡旋振荡洗脱颗粒。再旋转,除去上清。再次重复该步骤。
  4. 第二次洗脱除去上清后,高速离心样本3分钟。
  5. 用塑料移液管头除去所有剩余上清。试管室温晾干10-20分钟(必须除去酒精气味)。
  6. 加入TE缓冲液。注意:加入TE的量取决于起始DNA的量和目的用途所需的加入浓度。例如,如果加入25μl TE,基于完全恢复1μg DNA的最终浓度应为40ng/μl。快速强力涡旋振荡直到颗粒完全悬浮。用手轻打或轻敲内容物至管顶(但是不要离心)。
  7. 50-60℃下样本孵育15分钟以洗脱DNA。
  8. 高速离心2-3分钟并用塑料移液管头转移样本(上清)到新管。
  9. 进行MSP或测序,或-15~-25℃可保存达2个月,-80℃可保存6个月。避免重复融化和解冻;可分量储存。不要将DNA存储在自动除霜冰箱。
  10. 当从一管中转移已解冻的DNA以备用时,避免将试剂Ⅲ转移到PCR反应管中。通常首先将管充分离心,使残留的试剂Ⅲ固体成颗粒状。

MSP[编辑]

引物合成[编辑]

运用特别设计的针对甲基化和非甲基化序列的引物,引物由生物公司合成。

甲基引物序列及扩增条件
hMLH1引物 引物序列(5’~3’) 产物长度 温度
甲基化(M) 正义 ACGTAGACGTTTTATTAGGGTCGC 115 bp 55℃
甲基化(M) 反义 CCTCATCGTAACTACCCGCG 115 bp 55℃
非甲基化(U) 正义 TTTTGATGTAGATGTTTTATTAGGGTTGT 124 bp 55℃
非甲基化(U) 反义 ACCACCTCATCATAACTACCCACA 124 bp 55℃

PCR反应条件[编辑]

  • 反应体系:10×PCR缓冲液5μl,2.5mmol/LdNTP4μl,甲基化上下游引物和去甲基化上下游引物分别为1μl,甲基化模板DNA5μl,Taq酶0.25μl,加水至总体积50μl。
循环条件
程序 温度 时间
预变性 95℃ 60 sec
变性 95℃ 30 sec
退火 55℃ 30 sec
终末延伸 72℃ 60 sec
共35个循环

PCR产物结果判定:琼脂糖凝胶电泳[编辑]

  • 甲基化阳性:甲基化特异性引物扩增出相应长度的片断,但非甲基化特异性引物未扩增出相应长度的片断,则判断基因启动子区5’CpG岛甲基化阳性。
  • 甲基化阴性:非甲基化特异性引物扩增出相应长度的片断,但甲基化特异性引物未扩增出相应长度的片断。则判断基因启动子区5’CpG岛甲基化阴性。