生物化學與分子生物學/DNA實驗技術/甲基化檢測原理及步驟

DNA亞硫酸氫鹽修飾設計

使用CpGenome^TMkit使胞嘧啶轉化為尿嘧啶的步驟如下。中等溫度鹼性pH下使DNA變性成為單鏈形式暴露出鹼基。試劑一，一種包含亞硫酸氫根的鈉鹽，可使未甲基化的胞嘧啶磺化和水解脫氨，產生一種尿嘧啶磺酸鹽中間產物。然後DNA在另一種鹽﹙試劑二﹚存在的條件下與一種微粒載體﹙試劑三﹚結合，並通過重複離心和在70%的乙醇中重懸浮脫鹽。向尿嘧啶的轉化是通過在90%的乙醇中反覆鹼性脫磺酸基作用和脫鹽完成的。DNA最終在TE緩衝液中通過加熱從載體上洗脫下來。

第一步：試劑準備

1. 3 M NaOH原料（用前現配）：把1g干NaOH片劑溶解在8.3mL水中。使用此類腐蝕性鹼，注意小心謹慎和實驗操作。
2. 20 mM NaOH/90% EtOH（用前現配）配製1mL該溶液需：900μl 100%的乙醇，93.4μl水，6.6μl 3M的氫氧化鈉。
3. 溶解試劑Ⅰ（用前現配）：打開前將試劑瓶加溫至室溫。對每份待修飾的樣本，稱取0.227g DNA修飾試劑Ⅰ加入0.571mL水中。充分渦旋振盪混合。使用該試劑時要小心謹慎，因為它對呼吸系統和皮膚有刺激性。用大約20μl 3M NaOH調整pH至5.0，用pH試紙檢測pH值。試劑Ⅰ避光保存以免分解。為了最佳效果，試劑應在配置後立即使用。
4. 溶解試劑Ⅱ：打開前將試劑瓶加溫至室溫。將1μl β-巰基乙醇加入20mL去離子水中。每份待修飾的DNA樣本需將750μl該溶液加入到1.35g DNA修飾Ⅱ。充分混合確保完全溶解。過量的試劑可用箔紙包裹的容器、2℃-8℃、避光保存長達6周。

第二步：DNA修飾程序

1. 在帶有螺旋形瓶蓋的1.5-2.0mL的微量離心管中：將7.0μl 3M NaOH加入到含有1.0 μg DNA的100μl水中（10ng/μl），混勻。注意：如果樣本含有的DNA量不到1.0μg，就向樣本DNA中加入2 μl DNA修飾試劑Ⅳ並加水至總體積100μl。再加入7.0μl 3M NaOH並混勻。
2. 50℃ DNA孵育10分鐘（加熱塊或水浴）
3. 加入550 μl新鮮配製的DNA修飾試劑Ⅰ並渦旋振盪。
4. 加熱塊或水浴50℃避光孵育4-16小時。

第三步：初步脫鹽

1. 強力渦旋振盪懸浮DNA修飾Ⅲ。用10x的1mL塑料移液管槍頭來回吸排懸液以分散仍存在的凝塊。
2. 向含DNA溶液的管中加入5μl充分懸浮的DNA修飾試劑Ⅲ。
3. 加入750μl DNA修飾試劑Ⅱ並充分混勻。
4. 室溫孵育5-10分鐘。
5. 5000 X g離心10秒使DNA試劑Ⅲ成顆粒狀。（應出現一種白色的小顆粒。）棄去上清。
6. 加入1.0mL 70%的乙醇，渦旋振盪，5000 X g離心10秒，棄去上清。該步驟重複進行，共3次。
7. 將第三次上清棄去後，離心管高速離心2分鐘，用塑料移液管槍頭移去剩餘上清。

第四步：完成DNA修飾（脫磺酸基作用），再次脫鹽，並洗脫。

1. 適量樣本加入50μl 20 mM NaOH/90% EtOH溶液。
2. 充分渦旋振盪懸浮顆粒，再室溫孵育5分鐘。
3. 5000 X g離心以移除管頂所有成分。加入1.0mL 90%的乙醇並渦旋振盪洗脫顆粒。再旋轉，除去上清。再次重複該步驟。
4. 第二次洗脫除去上清後，高速離心樣本3分鐘。
5. 用塑料移液管頭除去所有剩餘上清。試管室溫晾乾10-20分鐘（必須除去酒精氣味）。
6. 加入TE緩衝液。注意：加入TE的量取決於起始DNA的量和目的用途所需的加入濃度。例如，如果加入25μl TE，基於完全恢復1μg DNA的最終濃度應為40ng/μl。快速強力渦旋振盪直到顆粒完全懸浮。用手輕打或輕敲內容物至管頂（但是不要離心）。
7. 50-60℃下樣本孵育15分鐘以洗脫DNA。
8. 高速離心2-3分鐘並用塑料移液管頭轉移樣本（上清）到新管。
9. 進行MSP或測序，或-15～-25℃可保存達2個月，-80℃可保存6個月。避免重複融化和解凍；可分量儲存。不要將DNA存儲在自動除霜冰箱。
10. 當從一管中轉移已解凍的DNA以備用時，避免將試劑Ⅲ轉移到PCR反應管中。通常首先將管充分離心，使殘留的試劑Ⅲ固體成顆粒狀。

MSP

引物合成

運用特別設計的針對甲基化和非甲基化序列的引物，引物由生物公司合成。

甲基引物序列及擴增條件

hMLH1引物	引物序列(5』～3』)	產物長度	溫度
甲基化(M) 正義	ACGTAGACGTTTTATTAGGGTCGC	115 bp	55℃
甲基化(M) 反義	CCTCATCGTAACTACCCGCG	115 bp	55℃
非甲基化(U) 正義	TTTTGATGTAGATGTTTTATTAGGGTTGT	124 bp	55℃
非甲基化(U) 反義	ACCACCTCATCATAACTACCCACA	124 bp	55℃

PCR反應條件

• 反應體系：10×PCR緩衝液5μl，2.5mmol/LdNTP4μl，甲基化上下游引物和去甲基化上下游引物分別為1μl，甲基化模板DNA5μl，Taq酶0.25μl，加水至總體積50μl。

循環條件

程序	溫度	時間
預變性	95℃	60 sec
變性	95℃	30 sec
退火	55℃	30 sec
終末延伸	72℃	60 sec
共35個循環

PCR產物結果判定：瓊脂糖凝膠電泳

• 甲基化陽性：甲基化特異性引物擴增出相應長度的片斷，但非甲基化特異性引物未擴增出相應長度的片斷，則判斷基因啟動子區5』CpG島甲基化陽性。
• 甲基化陰性：非甲基化特異性引物擴增出相應長度的片斷，但甲基化特異性引物未擴增出相應長度的片斷。則判斷基因啟動子區5』CpG島甲基化陰性。