生物化学与分子生物学/PCR实验技术/RT-PCR操作步骤

逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。

1. 实验方法：逆转录-聚合酶链反应
2. 实验材料：组织或细胞样品
3. 试剂、试剂盒：
   • RNA提取试剂
   • dNTP 混合物
   • Taq DNA聚合酶
   • 第一链cDNA合成试剂盒
4. 仪器、耗材：
   • 离心管
   • 离心机
   • 水浴锅
   • PCR管
   • 电泳仪
   • 凝胶图像分析系统

反转录酶的选择

1. Money 鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37℃。
2. 禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42℃。
3. Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。
4. MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为Superscript 和SuperScriptⅡ。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。

合成cDNA引物的选择

1. 随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。
2. Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3’端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。
3. 特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA 3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。

试剂准备

1. RMA提取试剂
2. 第一链cDNA合成试剂盒
3. dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
4. Taq DNA聚合酶

操作步骤

1. 总RNA的提取：见相关内容。
2. cDNA第一链的合成：目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System  for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。
   • ① 在0.5ml微量离心管中，加入总RNA 1-5μg，补充适量的DEPC H2O使总体积达11μl。在管中加10μM Oligo（dT）12-18 1μl，轻轻混匀、离心。
   • ② 70℃加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min。
   • 然后加入下列试剂的混合物：10×PCR buffer  2μl；25mM MgCl2  2μl；10mM dNTPmix 1μl；0.1M DTT  2μl 轻轻混匀，离心。42℃孵育2-5min。
   • ③ 加入SuperscriptⅡ1μl ，在42℃水浴中孵育50min。
   • ④ 于70℃加热15min以终止反应。
   • ⑤ 将管插入冰中，加入RNase H 1μl ，37℃孵育20min，降解残留的RNA。-20℃保存备用。
3. PCR：
   • ① 取0.5ml PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA   2μl；上游引物（10pM） 2μl；下游引物（10pM） 2μl；dNTP(2mM) 4μl；10×PCR buffer 5μl；Taq 酶（2u/μl） 1μl。
   • ② 加入适量的ddH2O，使总体积达50μl。轻轻混匀，离心。
   • ③ 设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参（如G3PD）的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照。
   • ④ 电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。
   • ⑤ 密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。

注意事项

1. 在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂。
2. 为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。
3. 内参的设定：主要为了用于靶RNA的定量。常用的内参有G3PD（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、β-Actin（β-肌动蛋白）等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。
4. PCR不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定。
5. 防止DNA的污染：① 采用DNA酶处理RNA样品；② 在可能的情况下，将PCR引物置于基因的不同外显子，以消除基因和mRNA的共线性。