跳至內容

生物化學與分子生物學/PCR實驗技術/RT-PCR操作步驟

維基教科書,自由的教學讀本

逆轉錄-聚合酶鏈反應 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)的原理是:提取組織或細胞中的總RNA,以其中的mRNA作為模板,採用Oligo(dT)或隨機引物利用逆轉錄酶反轉錄成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增,而獲得目的基因或檢測基因表達。RT-PCR使RNA檢測的靈敏性提高了幾個數量級,使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。該技術主要用於:分析基因的轉錄產物、獲取目的基因、合成cDNA探針、構建RNA高效轉錄系統。

  1. 實驗方法:逆轉錄-聚合酶鏈反應
  2. 實驗材料:組織或細胞樣品
  3. 試劑、試劑盒:
    • RNA提取試劑
    • dNTP 混合物
    • Taq DNA聚合酶
    • 第一鏈cDNA合成試劑盒
  4. 儀器、耗材:
    • 離心管
    • 離心機
    • 水浴鍋
    • PCR管
    • 電泳儀
    • 凝膠圖像分析系統

反轉錄酶的選擇[編輯]

  1. Money 鼠白血病病毒(MMLV)反轉錄酶:有強的聚合酶活性,RNA酶H活性相對較弱。最適作用溫度為37℃。
  2. 禽成髓細胞瘤病毒(AMV)反轉錄酶:有強的聚合酶活性和RNA酶H活性。最適作用溫度為42℃。
  3. Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜熱微生物的熱穩定性反轉錄酶:在Mn2+存在下,允許高溫反轉錄RNA,以消除RNA模板的二級結構。
  4. MMLV反轉錄酶的RNase H-突變體:商品名為Superscript 和SuperScriptⅡ。此種酶較其它酶能多將更大部分的RNA轉換成cDNA,這一特性允許從含二級結構的、低溫反轉錄很困難的mRNA模板合成較長cDNA。

合成cDNA引物的選擇[編輯]

  1. 隨機六聚體引物:當特定mRNA由於含有使反轉錄酶終止的序列而難於拷貝其全長序列時,可採用隨機六聚體引物這一不特異的引物來拷貝全長mRNA。用此種方法時,體系中所有RNA分子全部充當了cDNA第一鏈模板,PCR引物在擴增過程中賦予所需要的特異性。通常用此引物合成的cDNA中96%來源於rRNA。
  2. Oligo(dT):是一種對mRNA特異的方法。因絕大多數真核細胞mRNA具有3』端Poly(A+)尾,此引物與其配對,僅mRNA可被轉錄。由於Poly(A+)RNA僅占總RNA的1-4%,故此種引物合成的cDNA比隨機六聚體作為引物和得到的cDNA在數量和複雜性方面均要小。
  3. 特異性引物:最特異的引發方法是用含目標RNA的互補序列的寡核苷酸作為引物,若PCR反應用二種特異性引物,第一條鏈的合成可由與mRNA 3』端最靠近的配對引物起始。用此類引物僅產生所需要的cDNA,導致更為特異的PCR擴增。

試劑準備[編輯]

  1. RMA提取試劑
  2. 第一鏈cDNA合成試劑盒
  3. dNTPmix:含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
  4. Taq DNA聚合酶

操作步驟[編輯]

  1. 總RNA的提取:見相關內容。
  2. cDNA第一鏈的合成:目前試劑公司有多種cDNA第一鏈試劑盒出售,其原理基本相同,但操作步驟不一。現以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System  for First Strand cDNA Synthesis 試劑盒為例。
    • ① 在0.5ml微量離心管中,加入總RNA 1-5μg,補充適量的DEPC H2O使總體積達11μl。在管中加10μM Oligo(dT)12-18 1μl,輕輕混勻、離心。
    • ② 70℃加熱10min,立即將微量離心管插入冰浴中至少1min。
    • 然後加入下列試劑的混合物:10×PCR buffer  2μl;25mM MgCl2  2μl;10mM dNTPmix 1μl;0.1M DTT  2μl 輕輕混勻,離心。42℃孵育2-5min。
    • ③ 加入SuperscriptⅡ1μl ,在42℃水浴中孵育50min。
    • ④ 於70℃加熱15min以終止反應。
    • ⑤ 將管插入冰中,加入RNase H 1μl ,37℃孵育20min,降解殘留的RNA。-20℃保存備用。
  3. PCR:
    • ① 取0.5ml PCR管,依次加入下列試劑:第一鏈cDNA   2μl;上游引物(10pM) 2μl;下游引物(10pM) 2μl;dNTP(2mM) 4μl;10×PCR buffer 5μl;Taq 酶(2u/μl) 1μl。
    • ② 加入適量的ddH2O,使總體積達50μl。輕輕混勻,離心。
    • ③ 設定PCR程序。在適當的溫度參數下擴增28-32個循環。為了保證實驗結果的可靠與準確,可在PCR擴增目的基因時,加入一對內參(如G3PD)的特異性引物,同時擴增內參DNA,作為對照。
    • ④ 電泳鑑定:行瓊脂糖凝膠電泳,紫外燈下觀察結果。
    • ⑤ 密度掃描、結果分析:採用凝膠圖像分析系統,對電泳條帶進行密度掃描。

注意事項[編輯]

  1. 在實驗過程中要防止RNA的降解,保持RNA的完整性。在總RNA的提取過程中,注意避免mRNA的斷裂。
  2. 為了防止非特異性擴增,必須設陰性對照。
  3. 內參的設定:主要為了用於靶RNA的定量。常用的內參有G3PD(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)、β-Actin(β-肌動蛋白)等。其目的在於避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應體系中擴增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差。
  4. PCR不能進入平台期,出現平台效應與所擴增的目的基因的長度、序列、二級結構以及目標DNA起始的數量有關。故對於每一個目標序列出現平台效應的循環數,均應通過單獨實驗來確定。
  5. 防止DNA的污染:① 採用DNA酶處理RNA樣品;② 在可能的情況下,將PCR引物置於基因的不同外顯子,以消除基因和mRNA的共線性。