生物化学与分子生物学/DNA损伤修复

DNA损伤和损伤修复 - DNA损伤 - DNA损伤修复 - DNA损伤及其修复的意义
在生命的各种活动中，生物体发生DNA损伤不可避免。这种损伤所导致的结局取决于DNA损伤的程度，以及细胞对损伤DNA的修复能力。DNA损伤修复是指纠正DNA两条单链间错配的碱基、清除DNA链上受损的碱基或糖基、恢复DNA的正常结构的过程。DNA修复(DNA repair)是机体维持DNA结构的完整性与稳定性，保证生命延续和物种稳定的重要环节。
细胞内存在多种修复DNA损伤的途径或系统。常见的DNA损伤修复途径或系统包括，直接修复、切除修复、重组修复和损伤跨越修复等。值得注意的是，一种DNA损伤可通过多种途径修复，而一种修复途径也可同时参与多种DNA损伤的修复过程。

有些DNA损伤可以直接修复

直接修复是最简单的一种DNA损伤的修复方式。修复酶直接作用于受损的DNA,将之恢复为原来的结构。

• 嘧啶二聚体的直接修复 嘧啶二聚体的直接修复又称为光复活修复或光复活作用。生物体内存在着一种DNA光裂合酶(DNA photolyase), 能够直接识别和结合于DNA链上的嘧啶二聚体部位。在可见光(400nm)激发下，光复活酶可将嘧啶二聚体解聚为原来的单体核苷酸形式，完成修复。DNA光裂合酶最初在低等生物中发现，有两个与吸收光子有关的生色基团，次甲基四氢叶酸和FADH₂。次甲基四氢叶酸吸收光子后将FAD比激活，再由激活的FADH₂将电子转移给嘧啶二聚体，使其还原。鸟类等高等生物虽然也存在DNA光裂合酶，但是光复活修复并不是高等生物修复嘧啶二聚体的主要方式。哺乳动物细胞缺乏DNA光裂合酶。
• 烷基化喊基的直接修复 催化此类直接修复的酶是一类特异的烷基转移酶，可以将烷基从核苷酸直接转移到自身肽链上，修复DNA的同时自身发生不可逆转的失活。比如，人类O⁶-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶，能够将O⁶位的甲基转移到酶自身的半胱氨酸残基上，使甲基化的鸟嘌呤恢复正常结构。
• 单链断裂的直接修复 DNA连接酶能够催化DNA双螺旋结构中一条链上缺口处的5'-磷酸基团与相邻片段的3'-羟基之间形成磷酸二酯键，从而直接参与DNA单链断裂的修复，如电离辐射所造成DNA单链上的切口。

切除修复是最普遍的DNA损伤修复方式

切除修复是生物界最普遍的一种DNA损伤修复方式。 通过此修复方式，可将不正常的碱基或核苷酸除去并替换掉。依据识别损伤机制的不同，又分为碱基切除修复和核苷酸切除修复两种类型。

碱基切除修复

碱基切除修复(base excision repair，BER)依赖于生物体内存在的一类特异的DNA糖苷酶。整个修复过程包括：①识别水解：DNA糖苷酶特异性识别DNA链中已受损的碱基并将其水解去除，产生一个无碱基位点；②切除：在此位点的5'-端，无碱基位点核酸内切酶将DNA链的磷酸二酯键切开，同时去除剩余的磷酸核糖部分；③合成：DNA聚合酶在缺口处以另一条链为模板修补合成互补序列；④连接：由DNA连接酶将切口重新连接，使DNA恢复正常结构。
抑癌蛋白p53在哺乳动物细胞中参与调控碱基切除修复。直接证据是 DNA 烷化剂诱导的DNA损伤，在表达野生型p53的细胞可被有效修复，而在p53缺失的细胞，其修复速度明显减慢。

核苷酸切除修复

与碱基切除修复不同，核苷酸切除修复(nucleotide excision repair, NER)系统并不识别具体的损伤，而是识别损伤对DNA双螺旋结构所造成的扭曲，但修复过程与碱基切除修复相似。首先，由一个酶系统识别DNA损伤部位；其次，在损伤部位两侧切开DNA链，去除两个切口之间的一段受损的寡核苷酸；再次，在DNA聚合酶作用下，以另一条链为模板，合成一段新的DNA, 填补缺损区；最后由连接酶连接，完成损伤修复。
切除修复是DNA损伤修复的一种普遍形式，它并不局限于某种特殊原因造成的损伤，而能一般性地识别和纠正DNA链及DNA双螺旋结构的变化，修复系统能够使用相同的机制和一套修复蛋白质去修复一系列性质各异的损伤。
人类的DNA损伤核背酸切除修复需要大约30多种蛋白质的参与。其修复过程如下：①由损伤部位识别蛋白XPC和XPA等，再加上DNA复制所需的SSB，结合在损伤DNA的部位；②XPB和XPD发挥解旋酶的活性，与上述蛋白质共同作用在受损DNA周围形成一个凸起；③XPG与XPF发生构象改变，分别在凸起的3'-端和5'-端发挥核酸内切酶活性，在增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)的帮助下，切除并释放受损的寡核苷酸；④遗留的缺损区由DNA聚合酶σ或ε进行修补合成；⑤由连接酶完成连接。
核苷酸切除修复不仅能够修复整个基因组中的损伤，而且能够修复那些正在转录的基因模板链上的损伤，后者又称为转录偶联修复(transcription-coupled repair), 因此，更具积极意义。在此修复中，所不同的是由RNA聚合酶承担起识别损伤部位的任务。

碱基错配修复

错配是指非Watson-Crick碱基配对。碱基错配修复也可被看作是碱基切除修复的一种特殊形式，是维持细胞中DNA结构完整稳定的重要方式，主要负责纠正以下错误：

• 复制与重组中出现的碱基配对错误；
• 因碱基损伤所致的碱基配对错误；
• 碱基插入；
• 碱基缺失。

从低等生物到高等生物，均拥有保守的碱基错配修复系统或途径。
大肠杆菌参与DNA复制中错配修复的蛋白质包括Mut(mutase)H、MutL、MutS、DNA解旋酶、单链DNA结合蛋白、核酸外切酶Ⅰ、DNA聚合酶Ⅲ，以及DNA连接酶等10余种蛋白质或相关酶成分，修复过程十分复杂。修复过程中面临的主要问题是如何区分母链和子链。在细菌DNA中甲基化修饰是一个重要标志，母链是高度甲基化的，主要是其腺嘌呤A发生甲基化修饰，而新合成子链中的腺嘌呤A的甲基化修饰尚未进行，这提示错配修复应在此链上进行。首先由MutS蛋白识别错配碱基，随后由MutL和MutH等蛋白质协同相应的核酸外切酶，将包含错配点在内的一小段DNA水解、切除，经修补、连接后，恢复DNA正确的碱基配对。
继细菌错配修复机制被揭示之后，真核细胞的错配修复机制的研究，近年来也取得很大进展。现已发现多种与大肠杆菌的MutS和MutL高度同源的参与错配修复的蛋白质，如与大肠杆菌MutS高度同源的人类的MSH2(MutS Homolog 2)、MSH6和MSH3等。MSH2和MSH6的复合物可识别包括碱基错配、插入、缺失等DNA损伤，而由MSH2和MSH3形成的蛋白质复合物则主要识别碱基的插入与缺失。真核细胞并不像原核细胞那样以甲基化来区分母链和子链，可能是依赖修复酶与复制复合体之间的联合作用识别新合成的子链。

DNA严重损伤时需要重组修复

双链DNA分子中的一条链断裂，可被模板依赖的DNA修复系统修复，不会给细胞带来严重后果。然而，DNA分子的双链断裂是一种极为严重的损伤。与其他修复方式不同的是，双链断裂修复由于没有互补链可言，因此难以直接提供修复断裂所必需的互补序列信息。为此，需要另外一种更为复杂的机制，即重组修复来完成DNA双链断裂的修复。重组修复是指依靠重组酶系，将另一段未受损伤的DNA移到损伤部位，提供正确的模板，进行修复的过程。依据机制的不同，重组修复可分为同源重组修复和非同源末端连接重组修复。

同源重组修复

同源重组修复(homologous recombination repair)指的是参加重组的两段双链 DNA 在相当长的范围内序列相同(≥200bp),这样就能保证重组后生成的新区序列正确。大肠杆菌同源重组的分子机制已比较清楚，起关键作用的是 RecA 蛋白，也被称作重组酶，它是一个由352个氨基酸组成的蛋白质。多个RecA单体在DNA上聚集，形成右手螺旋的核蛋白细丝，细丝中具有深的螺旋凹槽，可以识别和容纳 DNA 链。在 ATP 存在的清况下，RecA 可与损伤的 DNA 单链区结合，使 DNA 伸展，同时 RecA 可识别一段与受损 DNA 序列相同的姐妹链，并使之与受损 DNA 链并列排列，交叉互补，并分别以结构正常的两条 DNA 链为模板重建损伤链。最后在其他酶的作用下，解开交叉互补，连接新合成的链，完成同源重组。同源重组生成的新片段具有很高的忠实性。

非同源末端连接的重组修复

非同源末端连接重组修复(non-homologous end joining recombination repair)是哺乳动物细胞DNA双链断裂的一种修复方式，顾名思义，即两段DNA链的末端不需要同源性就能相互替代连接。因此，非同源末端连接重组修复的DNA链的同源性不高，修复的DNA序列中可存在一定的差异。对于拥有巨大基因组的哺乳动物细胞来说，发生错误的位置可能并不在必需基因上，这样依然可以维持受损细胞的存活。非同源末端连接重组修复中起关键作用的蛋白质分子是DNA依赖的蛋白激酶(DNA-dependent protein kinase, DNA-PK), 是一种核内的丝氨酸/氨酸蛋白激酶，由一个分子量大约为465kD的催化亚基(DNA-PKcs)和一个能结合DNA游离端的杂二聚体蛋白Ku组成。DNA-PKcs的作用是介导DNA-PK的催化功能，而Ku蛋白可与双链DNA的断端连接，促进双链断裂的重接。
另一个参与非同源末端连接重组修复的重要蛋白质是XRCC4(X-ray repair, complementing defective, in Chinese hamster), 它能与DNA连接酶形成复合物，增强连接酶的活力，在DNA连接酶与组装在DNA末端的DNA-PK复合物相结合的过程中起中间体作用。非同源末端连接重组修复既是修复DNA损伤的一种方式，又可以被看作是一种生理性基因重组的策略，将原来并未连在一起的基因或片段连接产生新的组合，如B淋巴细胞、T淋巴细胞的受体基因、免疫球蛋白基因的构建与重排等。

跨越损伤DNA合成是一种差错倾向性DNA损伤修复

当DNA双链发生大范围的损伤，DNA损伤部位失去了模板作用，或复制叉已解开母链，致使修复系统无法通过上述方式进行有效修复，此时，细胞可以诱导一个或多个应急途径，通过跨过损伤部位先进行复制，再设法修复。而根据损伤部位跨越机制的不同，这种跨越损伤DNA的修复又被分为重组跨越损伤修复与合成跨越损伤修复两种类型。

重组跨越损伤修复

当DNA链的损伤较大，致使损伤链不能作为模板复制时，细胞利用同源重组的方式，将DNA模板进行重组交换，使复制能够继续下去。然而，在大肠杆菌中，还有某些新的机制，当复制进行到损伤部位时，DNA聚合酶Ⅲ停止移动，并从模板上脱离下来，然后在损伤部位 的下游重新启动复制，从而在子链DNA上产生一个缺口。RecA重组蛋白将另一股健康母链上对应的序列重组到子链DNA的缺口处填补。通过重组跨越，解决了有损伤的DNA分子的复制问题，但其损伤并没有真正地被修复，只是转移到了另一个新合成的一个子代的DNA分子上，由细胞内其他修复系统来后继修复。

合成跨越损伤修复

当DNA双链发生大片段、高频率的损伤时，大肠杆菌可以紧急启动应急修复系统，诱导产生新的DNA聚合酶(DNA聚合酶Ⅳ或Ⅴ), 替换停留在损伤位点的原来的DNA聚合酶Ⅲ，在子链上以随机方式插入正确或错误的核昔酸使复制继续，越过损伤部位之后，这些新的 DNA聚合酶完成使命后从DNA链上脱离，再由原来的DNA聚合酶Ⅲ继续复制。因为诱导产生的这些新的DNA聚合酶的活性低，识别碱基的精确度差，一般无校对功能，所以这种合成跨越损伤复制过程的出错率会大大增加，是大肠杆菌SOS反应或SOS修复的一部分。
在大肠杆菌等原核细胞中，SOS修复反应是由RecA蛋白与LexA阻遏物的相互作用引发的，有近30个SOS相关基因编码蛋白质参与此修复反应。正常情况下，RecA基因以及其他的SOS相关的可诱导基因的上游，有一段共同的操纵序列(5'-CTG-N10-CAG-3')被LexA阻遏蛋白所阻遏，只有低水平的转录和翻译，产生少量的相应蛋白质。当DNA严重损伤时，RecA蛋白表达，激活LexA的自水解酶活性当LexA阻遏蛋白因水解从RecA基因，以及SOS相关的可诱导基因的操纵序列上解离下来后，一系列受LexA阻遏的基因得以表达，参与SOS修复活动。完成修复后，LexA阻遏蛋白重新合成，SOS相关的可诱导基因重新关闭。需要指出的是，SOS反应诱导的产物可参与重组修复、切除修 复和错配修复等修复过程。这种修复机制因海空紧急呼救信号"SOS"而得名。
此外，对于受损的DNA分子，除了启动上述诸多的修复途径，以修复损伤之外，细胞还可以通过其他的途径将损伤的后果降至最低。例如，通过DNA损伤应激反应活化的细胞周期检查点机制，延迟或阻断细胞周期进程，为损伤修复提供充足的时间，诱导修复基因转录翻译，加强损伤的修复，使细胞能够安全进入新一轮的细胞周期。与此同时，细胞还可以激活凋亡机制，诱导严重受损的细胞凋亡，在整体上维持生物体基因组的稳定。