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生物化学与分子生物学/PCR实验技术/目的基因PCR扩增产物的克隆

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实验原理[编辑]

PCR产物回收[编辑]

在高离子盐存在的情况下,DNA片断选择性的吸附于离心柱内的硅基质膜上,再通过一系列快速的漂洗、离心的步骤去蛋白液和漂选液,将引物、核苷酸、蛋白酶等杂质去除,最后用低盐,高pH值的洗脱缓冲液将纯净DNA从硅基质膜上洗脱。

T载体与PCR产物的连接[编辑]

源DNA与载体分子的连接就是DNA重组,这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下,有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中,将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种:T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能,而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌DNA连接酶没有的特性,即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。但这种连接的效率比粘性末端的连接率低,一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。T4噬菌体DNA 连接酶催化DNA 连接反应分为3 步:首先,T4 DNA 连接酶与辅因子ATP形成酶-ATP复合物;然后,酶-ATP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上,使DNA腺苷化;最后产生一个新的磷酸二酯键,把切口封起来。连接反应通常将两个不同大小的片断相连。因为DNA片断有两个端点,所以切割时出现两种可能,一种是单酶切,另一种是双酶切,这两种酶切方法在基因工程操作中都经常用到。对于单酶切来说,载体与供体的末端都相同,连接可以在任何末端之间进行,这样就导致了大量的自连接产物。为了减少自环的高本底,可对载体进行5’除磷酸处理,原理是连接酶只能连接DNA片断的3’OH末端与5’端,所以除磷后载体不会自环。一旦有外源片断插入时,由外源片断提供5’端就能与载体进行连接。通过这种方法可大大减少由载体的自身成环造成的高本底。对于双酶切来说,无论载体与供体同一片段上都有不同的末端,这样就避免了载体与供体的自环,能使有效连接产物大大增加。双酶切的另一个特点是能将供体分子定向连接到载体上。

连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下粘末端的氢键结合是不稳定的。因此采取折中的温度,即12-16℃,连接12-16h(过夜),这样既可最大限度地发挥连接酶的活性,又兼顾到短暂配对结构的稳定。Taq DNA酶扩增的PCR产物,其DNA双链前后末端都有一个游离的A碱基,可以与T -Vector 末端游离的T碱基互补形成环状重组T质粒。

实验材料、试剂和仪器[编辑]

PCR扩增相关试剂、PCR仪、移液枪、低温离心机、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像系统、PCR产物回收试剂盒、pUCm-T载体。

实验步骤[编辑]

PCR扩增[编辑]

PCR反应体系[编辑]

10×PCR Buffer 2.5 μl
dNTPs 0.5 μl
Taq 0.2 μl
引物1 1.5 μl
引物2 1.5 μl
ddH20 17.3 μl
DNA模板 1.5 μl

注:每组做5管,其中4管用于PCR产物回收,1管作电泳检测时的对照

PCR反应程序[编辑]

1 94℃预变性  5min
2 94℃变性 45s
3 60℃退火 30s
4 72℃延伸 60s
2-4步骤,35循环
5 72℃延伸 10min
6 4℃ 保存

目的基因PCR扩增产物的琼脂糖电泳检测[编辑]

  1. 制备琼脂糖凝胶:称取0.2g琼脂糖,放入锥形瓶中,加入20ml 1.0×TBE缓冲液,置微波炉或水浴加热至完全溶化,取出摇匀,则为1%琼脂糖凝胶液。
  2. 取有机玻璃内槽,洗净,晾干,用橡皮膏将有机玻璃内槽的两端边缘封好(一定封严,不能留缝隙)。
  3. 将有机玻璃内槽放置于一水平位置,并放好样品梳子。
  4. 将冷到60℃左右的琼脂糖凝胶液,缓缓倒入有机玻璃内槽,直至有机玻璃板上形成一层均匀的胶面(注意不要形成气泡)。
  5. 待胶凝固后,取出梳子,取下橡皮膏,放在电泳槽内。
  6. 加入电泳缓冲液至电泳槽中。
  7. 用移液枪将已加入上样缓冲液的DNA样品加入加样孔中(记录点样顺序及点样量)。
  8. 接通电泳槽与电泳仪的电源(注意正负极,DNA片段从负极向正极移动)。DNA的迁移速度与电压成正比,最高电压不超过5V/cm。当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1~2cm处,停止电泳。

产物回收[编辑]

  1. 在紫外光下将琼脂糖凝胶上的目的片段切下,放入1.5 mL Eppendorf离心管中;加入500μl溶胶/结合液DB,充分混匀。
  2. 将上一步所得溶液加入吸附柱AC中(吸附柱放入收集管中),室温放置1 min,12000rpm离心30-60s,倒掉收集管中的废液。
  3. 加入700μl漂洗液WB,12000rpm离心1min,弃掉废液。
  4. 加入500μl漂洗液WB,12000rpm离心1 min,弃掉废液。
  5. 将吸附柱AC放回空收集管中,12000rpm离心2 min,尽量除去漂洗液,以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
  6. 取出吸附柱AC,放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中间部位加50μl洗脱缓冲液EB(洗脱缓冲液事先在65-70℃水浴中加热效果更好),室温放置2 min,12000rpm离心1 min。如果需要较多量DNA,可将得到的溶液重新加入离心吸附柱,离心1 min。

PCR产物与T载体的连接[编辑]

对于常规的DNA ligase连接反应,请参考下面的连接反应体系,或按DNA ligase的说明书进行操作。每个连接反应使用1μl  pMD 18-T载体,约0.2pmol PCR产物,在10μl连接体系中4℃连接过夜或室温连接1h。

T4 DNA Ligase Buffer(2X) 5μl
Purified PCR Product 1μl
pMD 18-T Vector 1μl
T4 DNA Ligase (5-10U/微升) 1μl
ddH2O up to 10μl

大肠杆菌感受态细胞的制备(氯化钙法)[编辑]

  • ① 挑取新鲜的E.coli.DH5α单菌落接种于一个含有10 ml LB液体培养基(不含抗生素)的试管中,于37℃恒温振荡(200 rpm)培养约4h(OD=0.2~0.4),取出后立即将其冰浴10min。
  • ② 在无菌条件下将冰浴后的菌液吸取1ml到冰冷的1.5ml无菌离心管中,于4℃下10000g离心1min,回收细菌。
  • ③ 每管中加入500 μl于4℃下预冷的CaCl2重悬沉淀,冰浴30min,于4℃下10000g离心1min,回收细菌沉淀物。
  • ④ 每管加入200 μl冰预冷的CaCl2,混匀即为感受态细胞,置4℃冰箱备用。

重组质粒转化大肠杆菌[编辑]

  • ① 取10 μl连接产物,加入内装100 μl感受态细胞的离心管中,轻弹管壁混匀,冰浴30 min。
  • ② 42℃热击90s后,迅速将离心管冰浴3~5min。
  • ③ 加入1 ml不含抗生素的LB液体培养基,混匀,于37 ℃下振荡培养(180 rpm)45 min。
  • ④ 4℃下,10000 g,离心1 min,吸出500 μl上清液弃去,再混匀,取200 μl涂布于含有100 μg/ml氨苄青霉素的LB培养基平板上(事先涂布4μl浓度为200 mg/mg IPTG和20μl浓度为40 mg/ml X-gal),待菌液被培养基完全吸收后,倒置平板于37℃培养12~16h,直至出现单菌落。再将培养皿置于4℃,使其完全显色(即出现蓝、白斑)。
  • ⑤ 连接产物转化实验的同时,以等体积的ddH2O代替连接产物,其操作同上,分别涂布于含抗生素和不含抗生素的LB平板上,分别作为阴性对照和阳性对照。

重组子克隆的鉴定(本部分视实验进程而定)[编辑]

挑取可能含有目的片段的白斑,接种到5 ml LB/Amp液体培养基中,37℃ 220 rpm摇床培养过夜。采用碱裂解法小量提取菌液质粒DNA,进行PCR扩增,检测PCR产物是否连接到载体中。

附:TBE电泳缓冲液的配制[编辑]

5×TBE(5倍体积的TBE贮存液)

配1000ml 5×TBE:
Tris 54g
硼酸 27.5g
0.5mol/l EDTA 20ml(pH 8.0)