生物化學與分子生物學/PCR實驗技術/目的基因PCR擴增產物的克隆

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實驗原理[編輯]

PCR產物回收[編輯]

在高離子鹽存在的情況下,DNA片斷選擇性的吸附於離心柱內的矽基質膜上,再通過一系列快速的漂洗、離心的步驟去蛋白液和漂選液,將引物、核苷酸、蛋白酶等雜質去除,最後用低鹽,高pH值的洗脫緩衝液將純淨DNA從矽基質膜上洗脫。

T載體與PCR產物的連接[編輯]

源DNA與載體分子的連接就是DNA重組,這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下,有Mg2+、ATP存在的連接緩衝系統中,將分別經酶切的載體分子與外源DNA分子進行連接。DNA連接酶有兩種:T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶。兩種DNA連接酶都有將兩個帶有相同粘性末端的DNA分子連在一起的功能,而且T4噬菌體DNA連接酶還有一種大腸桿菌DNA連接酶沒有的特性,即能使兩個平末端的雙鏈DNA分子連接起來。但這種連接的效率比粘性末端的連接率低,一般可通過提高T4噬菌體DNA連接酶濃度或增加DNA濃度來提高平末端的連接效率。T4噬菌體DNA 連接酶催化DNA 連接反應分為3 步:首先,T4 DNA 連接酶與輔因子ATP形成酶-ATP複合物;然後,酶-ATP複合物再結合到具有5』磷酸基和3』羥基切口的DNA上,使DNA腺苷化;最後產生一個新的磷酸二酯鍵,把切口封起來。連接反應通常將兩個不同大小的片斷相連。因為DNA片斷有兩個端點,所以切割時出現兩種可能,一種是單酶切,另一種是雙酶切,這兩種酶切方法在基因工程操作中都經常用到。對於單酶切來說,載體與供體的末端都相同,連接可以在任何末端之間進行,這樣就導致了大量的自連接產物。為了減少自環的高本底,可對載體進行5』除磷酸處理,原理是連接酶只能連接DNA片斷的3』OH末端與5』端,所以除磷後載體不會自環。一旦有外源片斷插入時,由外源片斷提供5』端就能與載體進行連接。通過這種方法可大大減少由載體的自身成環造成的高本底。對於雙酶切來說,無論載體與供體同一片段上都有不同的末端,這樣就避免了載體與供體的自環,能使有效連接產物大大增加。雙酶切的另一個特點是能將供體分子定向連接到載體上。

連接反應的溫度在37℃時有利於連接酶的活性。但是在這個溫度下粘末端的氫鍵結合是不穩定的。因此採取折中的溫度,即12-16℃,連接12-16h(過夜),這樣既可最大限度地發揮連接酶的活性,又兼顧到短暫配對結構的穩定。Taq DNA酶擴增的PCR產物,其DNA雙鏈前後末端都有一個游離的A鹼基,可以與T -Vector 末端游離的T鹼基互補形成環狀重組T質體。

實驗材料、試劑和儀器[編輯]

PCR擴增相關試劑、PCR儀、移液槍、低溫離心機、瓊脂糖凝膠電泳系統、凝膠成像系統、PCR產物回收試劑盒、pUCm-T載體。

實驗步驟[編輯]

PCR擴增[編輯]

PCR反應體系[編輯]

10×PCR Buffer 2.5 μl
dNTPs 0.5 μl
Taq 0.2 μl
引物1 1.5 μl
引物2 1.5 μl
ddH20 17.3 μl
DNA模板 1.5 μl

註:每組做5管,其中4管用於PCR產物回收,1管作電泳檢測時的對照

PCR反應程序[編輯]

1 94℃預變性  5min
2 94℃變性 45s
3 60℃退火 30s
4 72℃延伸 60s
2-4步驟,35循環
5 72℃延伸 10min
6 4℃ 保存

目的基因PCR擴增產物的瓊脂糖電泳檢測[編輯]

  1. 製備瓊脂糖凝膠:稱取0.2g瓊脂糖,放入錐形瓶中,加入20ml 1.0×TBE緩衝液,置微波爐或水浴加熱至完全溶化,取出搖勻,則為1%瓊脂糖凝膠液。
  2. 取有機玻璃內槽,洗淨,晾乾,用橡皮膏將有機玻璃內槽的兩端邊緣封好(一定封嚴,不能留縫隙)。
  3. 將有機玻璃內槽放置於一水平位置,並放好樣品梳子。
  4. 將冷到60℃左右的瓊脂糖凝膠液,緩緩倒入有機玻璃內槽,直至有機玻璃板上形成一層均勻的膠面(注意不要形成氣泡)。
  5. 待膠凝固後,取出梳子,取下橡皮膏,放在電泳槽內。
  6. 加入電泳緩衝液至電泳槽中。
  7. 用移液槍將已加入上樣緩衝液的DNA樣品加入加樣孔中(記錄點樣順序及點樣量)。
  8. 接通電泳槽與電泳儀的電源(注意正負極,DNA片段從負極向正極移動)。DNA的遷移速度與電壓成正比,最高電壓不超過5V/cm。當溴酚藍染料移動到距凝膠前沿1~2cm處,停止電泳。

產物回收[編輯]

  1. 在紫外光下將瓊脂糖凝膠上的目的片段切下,放入1.5 mL Eppendorf離心管中;加入500μl溶膠/結合液DB,充分混勻。
  2. 將上一步所得溶液加入吸附柱AC中(吸附柱放入收集管中),室溫放置1 min,12000rpm離心30-60s,倒掉收集管中的廢液。
  3. 加入700μl漂洗液WB,12000rpm離心1min,棄掉廢液。
  4. 加入500μl漂洗液WB,12000rpm離心1 min,棄掉廢液。
  5. 將吸附柱AC放回空收集管中,12000rpm離心2 min,儘量除去漂洗液,以免漂洗液中殘留乙醇抑制下游反應。
  6. 取出吸附柱AC,放入一個乾淨的離心管中,在吸附膜的中間部位加50μl洗脫緩衝液EB(洗脫緩衝液事先在65-70℃水浴中加熱效果更好),室溫放置2 min,12000rpm離心1 min。如果需要較多量DNA,可將得到的溶液重新加入離心吸附柱,離心1 min。

PCR產物與T載體的連接[編輯]

對於常規的DNA ligase連接反應,請參考下面的連接反應體系,或按DNA ligase的說明書進行操作。每個連接反應使用1μl  pMD 18-T載體,約0.2pmol PCR產物,在10μl連接體系中4℃連接過夜或室溫連接1h。

T4 DNA Ligase Buffer(2X) 5μl
Purified PCR Product 1μl
pMD 18-T Vector 1μl
T4 DNA Ligase (5-10U/微升) 1μl
ddH2O up to 10μl

大腸桿菌感受態細胞的製備(氯化鈣法)[編輯]

  • ① 挑取新鮮的E.coli.DH5α單菌落接種於一個含有10 ml LB液體培養基(不含抗生素)的試管中,於37℃恆溫振盪(200 rpm)培養約4h(OD=0.2~0.4),取出後立即將其冰浴10min。
  • ② 在無菌條件下將冰浴後的菌液吸取1ml到冰冷的1.5ml無菌離心管中,於4℃下10000g離心1min,回收細菌。
  • ③ 每管中加入500 μl於4℃下預冷的CaCl2重懸沉澱,冰浴30min,於4℃下10000g離心1min,回收細菌沉澱物。
  • ④ 每管加入200 μl冰預冷的CaCl2,混勻即為感受態細胞,置4℃冰箱備用。

重組質體轉化大腸桿菌[編輯]

  • ① 取10 μl連接產物,加入內裝100 μl感受態細胞的離心管中,輕彈管壁混勻,冰浴30 min。
  • ② 42℃熱擊90s後,迅速將離心管冰浴3~5min。
  • ③ 加入1 ml不含抗生素的LB液體培養基,混勻,於37 ℃下振盪培養(180 rpm)45 min。
  • ④ 4℃下,10000 g,離心1 min,吸出500 μl上清液棄去,再混勻,取200 μl塗佈於含有100 μg/ml氨苄青黴素的LB培養基平板上(事先塗布4μl濃度為200 mg/mg IPTG和20μl濃度為40 mg/ml X-gal),待菌液被培養基完全吸收後,倒置平板於37℃培養12~16h,直至出現單菌落。再將培養皿置於4℃,使其完全顯色(即出現藍、白斑)。
  • ⑤ 連接產物轉化實驗的同時,以等體積的ddH2O代替連接產物,其操作同上,分別塗佈於含抗生素和不含抗生素的LB平板上,分別作為陰性對照和陽性對照。

重組子克隆的鑑定(本部分視實驗進程而定)[編輯]

挑取可能含有目的片段的白斑,接種到5 ml LB/Amp液體培養基中,37℃ 220 rpm搖床培養過夜。採用鹼裂解法小量提取菌液質體DNA,進行PCR擴增,檢測PCR產物是否連接到載體中。

附:TBE電泳緩衝液的配製[編輯]

5×TBE(5倍體積的TBE貯存液)

配1000ml 5×TBE:
Tris 54g
硼酸 27.5g
0.5mol/l EDTA 20ml(pH 8.0)