生物化学与分子生物学/RNA实验技术/RNA琼脂糖凝胶电泳
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实验目的
[编辑]掌握植物总RNA非变性胶电泳的原理和方法。
实验原理
[编辑]RNA电泳可以在变性及非变性两种条件下进行。非变性电泳使用1.0%--1.4%的凝胶，不同的RNA条带也能分开，但无法判断其分子量。只有在完全变性的条件下，RNA的泳动率才与分子量的对数呈线性关系。因此要测定RNA分子量时，一定要用变性凝胶。在需快速检测所提总RNA样品完整性时，配制普通的1%琼脂糖凝胶即可。
实验材料、器具及药品
[编辑]蘑菇的总RNA溶液。 电泳仪，电泳槽，电子天平，移液器，枪头，微波炉，紫外透射检测仪等。 琼脂糖，1XTAE电泳缓冲液，0.5μg/ml溴化乙锭（EB）10X载样缓冲液。
实验步骤
[编辑]- 用1×TAE电泳缓冲液制作琼脂糖凝胶，加1×TAE电泳缓冲液至液面覆盖凝胶。
- 在超净工作台上，用移液器吸取总RNA样品4μl于封口膜上。在实验台上再加入5μl 1×TAE电泳缓冲液及1μl 的10X载样缓冲液，混匀后，小心加入点样孔。
- 打开电源开关，调节电压至100V，使RNA由负极向正极电泳，约30min后将凝胶放入EB染液中染色5min,用清水稍微漂洗。在紫外透射检测仪上观察RNA电泳结果。
RNA的变性琼脂糖凝胶检测
[编辑]试剂
[编辑]- MOPS缓冲液（10*）:0.4mol/L 吗啉代丙烷磺酸（MOPS） (Ph7.0)，0.1mol/L NaAc, 10mol/L EDTA。
- 上样染料：50%甘油，1mmol/L EDTA ,0.4%溴酚蓝，0.4%二甲苯蓝。
- 甲醛。
- 去离子甲酰胺。v电泳槽清洗：去污剂洗干净（一般浸泡过夜）——水冲洗——乙醇干燥——3%H2O2灌满——室温放置10分钟——0.1%DEPC水冲洗。
操作
[编辑]- 将制胶用具用70%乙醇冲冼一遍，晾干备用。
- 配制琼脂糖凝胶。
- ①称取0.5g琼脂糖，置干净的100ml 锥形瓶中，加入40ml蒸馏水，微波炉内加热使琼脂糖彻底溶化均匀。
- ②待胶凉至60--70 ℃，依次向其中加入9ml 甲醛、5ml 10X MOPS缓冲液和0.5ul 溴化乙锭，混合均匀。
- ③灌制琼脂糖凝胶。
样品准备：
[编辑]- ① 取 DEPC处理过的500ul小离心管，依次加入如下试剂： 10x MOPS缓冲液2ul，甲醛3.5ul,甲酰胺（去离子）10ul，RNA 样品 4.5ul,混匀。
- ② 将离心管置于60℃水浴中保10分钟，再置冰上2分钟。
- ③ 向管中加入3ul 上样染料，混匀。
上样
[编辑]电泳
[编辑]电泳槽内加入1XMOPS缓冲液，于7.5V/ml 的电压下电泳。
电泳结束后，在紫外灯下检查结果。